动物垫料中大肠菌群检测
动物垫料中大肠菌群检测
ICS 07.100.99 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1849—2020 动物垫料中大肠菌群检测 Detection for coliforms in animal bedding 2020-02-25 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-03-25 实施 发 布 DB 15/T 1849—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治 区农牧业科学院。 本标准主要起草人：赵治国、延涵、崔强、王海艳、于志超、陈林军、敖威华、张晓东、盛万里、 罗晓平、李军燕。 I DB 15/T 1849—2020 动物垫料中大肠菌群检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中大肠菌群MPN计数法和平板计数法。 本标准适用于动物垫料中大肠菌群的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南第 2 部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。也包括动物笼内非直接与动物机体接触 的铺垫物。 3.2 大肠菌群 coliforms 培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的一群革兰氏阴性无芽胞杆菌。 3.3 最可能数 most probable number(MPN) 泊松分布的一种间接计数方法。 3.4 菌落形成单位 colony forming unit（CFU） 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 1 DB15/T 1849—2020 4 检验原理 4.1 MPN 计数法 MPN计数法是统计学和微生物学相结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其 未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 4.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带 有沉淀环的菌落。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 均质器。 漩涡混合器。 高压灭菌器。 菌落计数器。 无菌试管：18 mm×180 mm。 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌滤膜均质袋。 无菌锥形瓶：500 mL。 无菌量筒。 无菌规格板：5 cm×5 cm。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 6 培养基和试剂 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 2 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉汤：见附录 A.2。 煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤：见附录 A.3。 结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar，VRBA)：见附录 A.4。 无菌磷酸盐缓冲液：见附录 A.5。 无菌生理盐水：见附录 A.6。 NaOH 溶液（1 mol/L）：见附录 A.7。 DB 15/T 1849—2020 6.8 HCL 溶液（1 mol/L）：见附录 A.8。 7 MPN 计数法 7.1 采样 7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入225 mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质1 min～2 min，制 成1:10的样品匀液。 7.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm×5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格3次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉 拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复 采样1～4个规格板面积，采样量见表1，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液中，充分振 2 摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm ）。取1 mL样品原液注入含有9 mL无菌稀释液的试 管中，制成1:10的样品匀液。 表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 采样量 规格板数 m 2 cm 2 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 稀释 7.2.1 样品匀液的 pH 应在 6.5～7.5 之间，必要时用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCL 调节。 7.2.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 7.2.3 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10 倍递增系列稀释的样品匀液。每递增稀 释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 3 DB15/T 1849—2020 7.3 初发酵试验 每个样品选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，每个稀释度接种 3 管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1 mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤），36 ℃ ±1 ℃培养 24 h±2 h，观察导管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验（证实试验）， 如未产气则继续培养至 48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 7.4 复发酵试验(证实试验) 用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃ ±1 ℃培养 48 h±2 h，观察产气情况。产气者计为大肠菌群阳性管。 7.5 大肠菌群最可能数(MPN)的报告 2 按 7.4 确证的大肠菌群 BGLB 阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每 g（cm ）样品中大肠菌 群的 MPN 值。 8 平板计数法 8.1 采样 按 7.1 进行。 8.2 稀释 按7.2进行。 8.3 平板计数 8.3.1 选取 2～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1 mL。同时取 1 mL 磷酸 盐缓冲液或生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 8.3.2 及时将约 15 mL～20 mL 融化并恒温至 45 ℃～50 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，加 3 mL～4 mL VRBA 琼脂覆盖平 板表层。凝固后翻转平板，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 8.4 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典 型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。 8.5 证实试验 从每个VRBA平板上分别挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑 菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。BGLB肉汤管产气，可 报告为大肠菌群阳性。 8.6 大肠菌群平板计数结果计算与报告 4 DB 15/T 1849—2020 8.6.1 大肠菌群平板计数结果的计算 8.6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，分别计算经最后证实为大肠菌群阳性 2 的试管比例乘以 8.4 中计数的平板菌落数，计算平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，即为每 g (cm ) -2 样品中大肠菌群数。例：加入 10 样品稀释液的 2 个 VRBA 平板上分别有 82 个和 64 个典型或可疑菌落， 从每个平皿分别挑取其中 10 个菌落接种 BGLB 肉汤管，分别证实有 7 个和 8 个阳性管，则该样品的大肠 2 3 2 菌群数为：（82×7/10+64×8/10）×10 ∕2 =5.4×10 CFU/g (cm )。 8.6.1.2 若有 2 个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，先计算适宜计数范围内每个平皿经 最后证实为大肠菌群阳性的菌落数，再按公式（1）计算样品中大肠菌群平板计数结果： N C (n1 0.1n2 )d ……………………………（1） 式中： N ——样品中大肠菌群板计数结果； ∑C ——平板（含适宜范围菌落数的平板）证实为大肠菌群阳性的菌落数之和； n1 ——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d ——稀释因子（第一稀释度）。 8.6.1.3 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.4 若所有平板上菌落数均小于 15 CFU，则应按稀释度最低的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在 15 CFU～150 CFU 之间，其中一部分小于 15 CFU 或大于 150 CFU 时，则以最接近 15 CFU 或 150 CFU，且稀释倍数较少的平皿菌落数进行确认，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.6 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 8.6.2 报告 8.6.2.1 大肠菌群平板计数结果按“四舍五入”原则修约。结果在 10 CFU 以内时，采用一位有效数字 报告；结果在 10 CFU～100 CFU 之间时，采用两位有效数字报告。 8.6.2.2 大肠菌群平板计数结果大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后， 取前 2 位数字，后面用 0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时按照“四舍五入” 原则修约，采用两位有效数字。具体修约规则按照 GB/T 8170 执行。 8.6.2.3 若空白对照平板上有大肠菌群菌落出现，则此次检验结果无效。 2 8.6.2.4 以 CFU/g 或 CFU/cm 为单位报告大肠菌群平板计数结果。 5 DB15/T 1849—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤 A.2.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 氯化钠 乳糖 磷酸氢二钾( K2HPO4) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 月桂基硫酸钠 蒸馏水 20.0 g 5.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 0.1 g 1000 mL A.2.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH至6.8±0.2，分装到有倒立发酵管的试管中，每管10 mL，121 ℃ 高压灭菌15 min备用。 A.3 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤 A.3.1 成分 蛋白胨 乳糖 牛胆盐 0.1%煌绿水溶液 蒸馏水 10.0 g 10.0 g 20.0 g 0.0133 g 1000 mL A.3.2 制法 准确称取以上成分，加1000 mL蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.2±0.2，分装于有倒立 发酵管的试管中，每管10 mL，121 ℃高压菌15 min备用。 A.4 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 6 DB 15/T 1849—2020 A.4.1 成分 蛋白胨 胆盐 酵母粉 乳糖 氯化钠 中性红 结晶紫 琼脂 蒸馏水 7.0 g 1.5 g 3.0 g 10.0 g 5.0 g 0.03 g 0.002 g 15.0 g 1000 mL A.4.2 制法 准确称取以上成分，加1000 mL蒸馏水，静置几分钟，充分搅拌溶解，调节pH至7.4±0.1。煮沸2 min， 将培养基融化并恒温至45 ℃～50 ℃倾注平板。使用前3 h内制备。 A.5 磷酸盐缓冲液 A.5.1 成分 磷酸二氢钾(KH2PO4) 蒸馏水 34.0 g 500 mL A.5.2 制法 贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调 节pH至7.2±0.2，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于4 ℃冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min 备用。 A.6 无菌生理盐水 A.6.1 成分 氯化钠 蒸馏水 8.5 g 1000 mL A.6.2 制法 称取8.5 g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min备用。 A.7 1 mol/L NaOH溶液 A.7.1 成分 氢氧化钠 蒸馏水 40.0 g 1000 mL 7 DB15/T 1849—2020 A.7.2 制法 称取40 g氢氧化钠溶于1000 mL无菌蒸馏水中。 A.8 1 mol/L HCL 溶液 A.8.1 成分 HCL 蒸馏水 90 mL 1000 mL A.8.2 制法 量取浓盐酸90 mL，用无菌蒸馏水稀释至1000 mL。 8 DB 15/T 1849—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 2 每g(cm )检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。 表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 阳性管数 0.1 0.01 0.001 0 0 0 0 0 0 MPN 95%可信限 阳性管数 上限 下限 0.1 0.01 0.001 <3.0 — 9.5 2 2 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 0 3.0 0.15 11 2 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 1.2 0 3 0 9.4 1 0 0 1 0 1 MPN 95 %可信限 上限 下限 21 4.5 42 1 28 8.7 94 2 2 35 8.7 94 2 3 0 29 8.7 94 18 2 3 1 36 8.7 94 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —— 注1：本表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3管。 注2：表内所列检样量如改用1 g(mL)、0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字要相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、 0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字要相应提高10倍，其余类推。 _________________________________ 9