饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法

ICS 65.120 B 46 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 1997—2014 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测 定 液相色谱-串联质谱法 Determination of enrofloxacin，ciprofloxacin，norfloxacin in feeds——LC-MS/MS method 2014 - 02 - 28 发布 吉林 省 质 量技术 监督 局 2014 - 04 - 30 实施 发 布 DB22/T 1997-2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、吉林大学。 本标准主要起草人：李媛媛、刘斌、李滢倩、关树文、刘智、任明月、王颖。 I DB22/T 1997-2014 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定 液相色谱-串联质谱 法 1 范围 本标准规定了饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱测定。 本标准适用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的含量测定。 本标准方法检出限为10 μg /kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 用乙腈和磷酸盐缓冲溶液提取试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星，固相萃取小柱净化，5%氨 水甲醇溶液洗脱，供液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。 4 试剂与材料 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；除另有说明外，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 甲醇，色谱纯。 4.2 乙腈，色谱纯。 4.3 磷酸。 4.4 甲酸，色谱纯。 4.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）。 4.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.7 氨水。 4.8 磷酸盐缓冲溶液：称取 5.68 g 磷酸氢二钠(4.5)和 1.36 g 磷酸二氢钾(4.6)置于 1000 mL 烧杯中， 加入 800 mL 水溶解，用磷酸（4.3）调至 pH=3.0，再用水定容至 1000 mL。 4.9 氨水甲醇溶液(5%)：取 5 mL 氨水(4.7)与 95 mL 甲醇(4.1)混合。 1 DB22/T 1997-2014 4.10 甲酸水溶液(pH=3.0)：量取 500 mL 水，用甲酸（4.4）调 pH 值到 3.0。 4.11 甲醇水溶液(25%)：取 250 mL 甲醇(4.1)，加水稀释到 1000 mL。 4.12 甲醇-甲酸溶液(15+85)：量取 30 mL 甲醇(4.1)与 170 mL 甲酸溶液(4.9)混合。 4.13 恩诺沙星(CAS：93106-60-6)、环丙沙星(CAS：93107-08-5)、诺氟沙星(CAS：70458-96-7)标准 物质，纯度大于等于 95%。 4.14 标准贮备液(1.0 mg/mL)：称取 0.1 g（精确至 0.1 mg）标准物质(4.13)，至 100 mL 容量瓶，甲 醇(4.1)定容。2 ℃-4 ℃冷藏保存，可保存 6 个月。 4.15 混合标准工作液(1 μg/mL)： 用甲醇水溶液(4.11)分别配成浓度范围为 1ng/mL-60ng/mL 标准工 作溶液，现配。 4.16 Oasis HLB 固相萃取小柱或相当者：60mg，3mL。 4.17 滤膜：0.22 μm。 4.18 氮气。 5 仪器 5.1 液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾电离源。 5.2 涡旋振荡器。 5.3 固相萃取装置。 5.4 分析天平：感量 0.1 mg。 5.5 粉碎机。 5.6 旋转蒸发仪。 5.7 氮气吹干仪。 5.8 离心机。 6 试样制备 选取代表性饲料样品至少500 g，按照GB/T 20195制备试样。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样0.5 g(精确至0.1 mg)于50 mL具塞离心管中，准确加入6 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，涡旋混 匀，再加入10 mL乙腈(4.2)，于涡旋振荡器振荡提取1 min，5000 r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶 中，在残渣中加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，10 mL乙腈(4.2)，重复以上步骤，合并上清液，于50 ℃旋 转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)，混匀。 2 DB22/T 1997-2014 7.2 净化 固相萃取小柱先用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.8)活化，保持柱体湿润。将7.1的样 液以1 mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱，待液体完全流出后，先后以4 mL水，4 mL甲醇水溶液 (4.11)淋洗，抽干，用4 mL氨水甲醇溶液(4.9)洗脱于10 mL具刻度离心管中，洗脱液于50 ℃，氮吹至约 0.2 mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液(4.12)定容至1 mL，5000 r/min离心5 min,过0.2 μm滤膜，供液相 色谱串联质谱分析。 7.3 液相色谱-串联质谱测定 7.3.1 参考条件 a) b) c) d) e) 色谱柱：C8 柱 1(50mm ×2.1 mm (i.d )，5µm)，或其他等效柱； 色谱柱温度：30 ℃； 流速：0.2 mL/min； 进样体积：5 μL； 流动相比例：乙睛：0.1%甲酸溶液（15:85）。 7.3.2 MS/MS 参考条件 a) 离子源：电喷雾（ESI），正离子模式； b) 离子喷雾电压：4 kV； c) 雾化气：氮气，0.25 MPa； d) 干燥器：氮气，流速 10 L/min，温度 325 ℃； e) 扫描方式：多反应监测（MRM）； f) 监测离子：检测离子见表 1； g) 驻留时间：0.2 s； h) 脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到 检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。 表1 化合物中文名称 恩诺沙星 被测物的母离子和子离子参数表 化合物英文名称 CAS号 定性离子对 定量离子对 enrofloxacin 93106-60-6 360/316 360/316 360/342 环丙沙星 ciprofloxacin 93107-08-5 332/314 332/314 332/231 诺氟沙星 norfloxacin 70458-96-7 320/302 320/302 320/231 7.3.3 定性分析 按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致 （变化范围在±2.5%之内）；试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰 度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可以判断试样中存在待测组分。 3 DB22/T 1997-2014 表2 定性离子相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.3.4 定量分析 在仪器最佳工作条件下，对标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准工 作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 标准品多反应监测色谱图参见附录A中图A。 8 结果计算 测定结果可由计算机自动计算待测组分的含量，也可按式（1）计算： W= c ´ V ´1000 .................................... (1) m ´1000 式中： W——试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（μg /kg）； c——由标准曲线查得试液中被测组分的浓度，单位为微克每升（μg /L）； V——试样定容体积，单位为毫升（mL）； m——试样取样质量，单位为克（g）。 9 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值15%。 在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值15%。 4 DB22/T 1997-2014 A A 附 录 A （资料性附录） MRM 质量色谱谱图 图A.1 三种被测物混合标准溶液总离子流图（1.0 mg/L） 图A.2 诺氟沙星的 MRM 色谱图（1.0 mg/L） 5 DB22/T 1997-2014 图A.3 环丙沙星的 MRM 色谱图（1.0 mg/L） 图A.4 恩诺沙星的 MRM 色谱图 _________________________________ 6