动物尿液中β-受体激动剂测定 酶联免疫法

ICS 67.050 X 04 备案号：35743-2013 吉 林 DB 省 地 方 标 准 DB 22/T 1609—2012 动物尿液中β-受体激动剂测定 酶联免疫法 Determination of β-Agonists in animal urine—— Enzyme linkde immunosorbent assay 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1609—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、珲春出入境检验检疫局、白城出入境 检验检疫局。 本标准主要起草人：胡婷婷、李玲、张琦、杨帆、张勋、杨璐、冯博。 I DB22/T 1609—2012 动物尿液中β-受体激动剂测定 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了动物尿液中β-受体激动剂残留量的酶联免疫测定方法。 本标准适用于动物尿液中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗、马喷特罗、特布他林及卡布 特罗残留定性的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 检测的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对沙丁胺醇抗体的捕获抗体。加入沙丁胺醇抗体后， 会与捕获抗体结合。经过孵育及洗板步骤后，加入标准品、样品溶液及沙丁胺醇酶标记物（酶连接物）， 样品中的β-受体激动剂与沙丁胺醇酶连接物竞争沙丁胺醇抗体的连接位点（竞争性酶联免疫法）没有连 接的沙丁胺醇酶连接物在洗涤步骤中被除去。将底物/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶连接物将 发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450 nm处测量，吸光度值与 样品中的β-受体激动剂浓度成反比。几种待测物交叉反应率应不低于50%。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 氢氧化钠（NaOH）。 4.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.3 正己烷（C 6H 14）：色谱纯。 4.4 盐酸（HCl）。 4.5 β-受体激动剂检测试剂盒：应在有效期内使用，保存于 2 ℃-8 ℃。不同批次的试剂盒不可混用。 4.5.1 β-受体激动剂系列标准溶液：浓度依试剂盒要求确定。 4.5.2 酶标板。 1 DB22/T 1609—2012 4.5.3 抗体。 4.5.4 酶标记物。 4.5.5 底物/发色剂。 4.5.6 反应终止液。 4.5.7 样品稀释缓冲液。 4.5.8 洗涤缓冲液。 5 仪器与设备 5.1 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 5.2 微量加液器：单道 20 μL-200 μL，200 μL-1000 μL 微量加液器，多道 50 μL-250 μL 微量加液器。 5.3 振荡器。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 天平：感量为 0.01 g。 5.6 高速离心机。 6 分析步骤 6.1 试样处理 取20 μL尿液样品直接进行检测，如果尿液混浊，试验前先进行离心或过滤。 6.2 测定步骤 6.2.1 制备酶标记物和抗体使用液：1：10 稀释酶标记物和抗体，如取 200 μL 酶标记物及 2 mL 样品 稀释缓冲液（4.5.7）稀释并混合均匀。 6.2.2 依次向微孔中加入稀释后的酶标记物 10 μL，室温下孵育 15 min。 6.2.3 倒出孔中液体，每孔加入洗涤缓冲液（4.5.8）250 μL，弃去孔中液体，再将酶联板倒置在滤纸 上拍打，重复洗板 3 次。 6.2.4 加入标准溶液或试样溶液 20 μL，然后加入 100 μL 稀释后的酶标记物（6.2.1），用手轻摇微孔 板混合，在室温（20 ℃-25 ℃）孵育 30 min。 6.2.5 弃去孔中液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。每孔加入洗涤缓冲液 （4.5.8）250 μL，弃去孔中液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板 3 次。 6.2.6 加入 100 μL 底物/发色剂（4.5.5）到各微孔中，用手轻轻摇动微孔板混合，在室温（20 ℃-25 ℃） 下暗处孵育 15 min。 6.2.7 加入 100 μL 反应终止液（4.5.6），在 450 nm 处测定吸光度值。 2 DB22/T 1609—2012 7 结果计算和表述 7.1 计算相对吸光度值 分别计算标准和样品的平均吸光值。按式（1）计算标准液和样液的相对吸光度值。 X = B ´ 100% ……………………………………… （1） B0 式中： X—— 相对吸光度值； B—— 标准液或样液的平均吸光度值； B0—— 0 μg/L标准液的平均吸光度值。 7.2 绘制标准曲线 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值（log 10）为横坐标绘制标准曲线。每次试验均需重 新绘制标准曲线。 7.3 样品结果计算 通过标准曲线可以计算出样品的浓度值； 样品的β-受体激动剂残留物的总量按式（2）计算： X = C ´ n …………………………………………… （2） 式中： X—— 样品待测组分的量，单位为微克每千克（μg/kg）； C—— 样品待测组分的浓度； n—— 稀释倍数。 8 结果处理 阳性样品须用液相色谱—质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）确证。 9 筛查浓度范围 本方法的β-受体激动剂残留量的筛查范围为0.3 μg/kg～16.2 μg/kg。 _________________________________ 3