樱桃砧木组培快繁技术规程
樱桃砧木组培快繁技术规程
ICS 65.020.20 B 05 DB11 北 京 市 地 方 标 准 DB11/T 1648—2019 樱桃砧木组培快繁技术规程 Technical regulation for cherry rootstocks micropropagation 2019 - 06 - 18 发布 北京市市场监督管理局 2019 - 10 - 01 实施 发 布 DB11/T 1648—2019 目 次 前 言 .............................................................................. II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 容器、工具的清洗与灭菌 ............................................................ 2 5 培养基的配制 ...................................................................... 2 6 外植体的选取及清洗 ................................................................ 2 7 接种 .............................................................................. 2 8 初代培养 .......................................................................... 3 9 继代增殖培养 ...................................................................... 3 10 壮苗培养 ......................................................................... 3 11 生根培养 ......................................................................... 4 12 移栽过渡 ......................................................................... 4 附录 A（资料性附录）MS 培养基成分和含量 ............................................... 5 附录 B（资料性附录）组培各阶段的营养基配方 ............................................ 6 附录 C（资料性附录）温室环境的消毒方法 ................................................ 7 I DB11/T 1648—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由北京市园林绿化局提出并归口。 本标准由北京市园林绿化局组织实施。 本标准起草单位：北京市海淀区植物组织培养技术实验室、北京市植物组织培养工程技术研究中心、 北京市林业果树科学研究院。 本标准主要起草人：刘兰英、张军民、李春玲、杜建军、刘凤琴、张开春。 II DB11/T 1648—2019 樱桃砧木组培快繁技术规程 1 范围 本标准规定了樱桃砧木组培快繁过程中容器、工具的清洗与灭菌、培养基的配制、外植体的选取及 清洗、接种、初代培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、移栽过渡等技术要求。 本标准适用于海樱系列、蓝丁系列和吉塞拉系列樱桃砧木苗的组织培养快速繁殖。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306—2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 外植体 explant 从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。 [NY/T 2306—2013，定义 3.8] 3.2 接种 inoculation 将消毒后的外植体在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。 改写NY/T 2306—2013，定义3.3。 3.3 初代培养 primary culture 消毒后的外植体接种在无菌培养基中进行培养，获得初级无菌植物材料的培养阶段。 3.4 继代 subculture 将培养材料从老培养基中转接入新鲜培养基中继续培养的过程。 [NY/T 2306—2013，定义 3.2] 1 DB11/T 1648—2019 3.5 丛生芽 cluster buds 组织培养过程中诱导植物器官或愈伤组织产生的簇状芽。 3.6 瓶苗 in vitro plantlet 组织培养过程中生长在培养容器中的无菌苗。 4 容器、工具的清洗与灭菌 培养容器和接种工具的清洗应符合NY/T 2306—2013中6.1、6.2的要求，灭菌应符合NY/T 2306—2013 中8.1、8.2、8.4的要求。 5 培养基的配制 樱桃砧木组培快繁所选用的基本培养基是MS培养基，MS培养基的成分和含量参见附录A。不同培养 阶段添加植物生长调节剂的培养基配方参见附录B。培养基的配制和灭菌应符合NY/T 2306—2013第7章 的要求。 6 外植体的选取及清洗 6.1 外植体母株选取 选择品种纯正、来源可靠、生长旺盛、无病虫害的优良植株作为外植体的母株。 6.2 外植体采集 6.2.1 可于 2～3 月从母株上选取健壮的一年生枝条，放在 20℃～25℃的房间内水培，每天换水，待 枝条上叶芽萌发至 2cm 以上时，剪下作为外植体备用；也可于 5～9 月选取母株上半木质化的新梢作为 外植体备用，宜在植物表面露水干后采集新梢。 6.2.2 采集的外植体宜用塑料袋包装并做好品种标记，低温储运。 6.3 外植体清洗 去除外植体叶片，根据节间长短剪取带1～2个芽的2 cm～3 cm茎段，用中性洗涤剂溶液将外植体表 面洗净，流水冲洗10 min～30 min，备用。 7 接种 7.1 接种前准备 提前30 min打开超净工作台、操作间、缓冲间和更衣间等处的紫外灯进行消毒，同时打开电热灭菌 器。关掉紫外灯后，超净工作台宜开启10 min～20 min后使用。 2 DB11/T 1648—2019 接种人员穿戴好专用鞋、工作服、帽子和口罩进入接种室。将手、台面、接种工具用 75%酒精擦拭， 将接种工具插入电热灭菌器灭菌，灭菌后置于搁置架上冷却、备用。 7.2 接种操作 7.2.1 将清洗后的外植体转移到无菌瓶中，倒入 75%酒精直至没过外植体表面，轻摇瓶身 30 s～60 s 后将酒精倒去，用无菌水冲洗外植体 1～2 遍。 7.2.2 用 0.1%升汞消毒液浸没外植体材料，消毒 5 min～10 min，浸泡过程中不断轻摇瓶身，消毒结 束后，倒出并回收消毒液，外植体材料用无菌水清洗 3～4 遍。 7.2.3 消毒后的外植体置于放有消毒滤纸的培养皿中，待吸干表面水分后，底端向下竖直插入到芽诱 导培养基上，及时盖紧瓶盖或封口并扎紧。培养基配方参见附录 B。 7.2.4 将植物品种代号、培养基代号、接种日期及接种人等信息标示到培养瓶上。 8 初代培养 将接种好外植体的培养瓶放入温度为25 ℃±2 ℃的培养室进行培养，光照强度1500 Lux～2500 Lux，光照时间 10 h/d～12 h/d，培养周期为30 d左右。 培养过程中每周要检查1～2次，发现外植体褐化、污染、死亡时应立即剔除。 9 继代增殖培养 9.1 继代前准备 将要继代的培养瓶表面用75%的酒精擦拭消毒。其它准备见7.1。 9.2 继代操作 9.2.1 在超净工作台台面上距外侧边缘 10cm～20 cm 处打开培养瓶瓶盖，从母瓶中取出要继代的瓶苗， 去除基部褐化的组织和部分叶片。 9.2.2 把大的丛生芽团切割成单芽或含 2～4 个芽的芽丛，转接到新配制的增殖培养基上。单芽高度为 1cm 左右；芽丛每个芽高可小于 1cm。 9.2.3 每个培养瓶内转接芽的数量因培养容器大小而异，直径 7.5 cm～8 cm、容积 350 mL～370 mL 的培养瓶中可转接 8 株/瓶或 5 丛/瓶左右。转接芽基部插入培养基 0.5cm 左右，分布均匀，及时盖紧瓶 盖或封口并扎紧。 9.2.4 将植物品种代号、培养基代号、继代日期及人员信息标示到培养瓶上。 9.3 增殖培养 将继代转接好的瓶苗放入温度22℃±2 ℃的培养室培养，光照强度1500 Lux～2500 Lux，光照时间 10 h/d～12 h/d左右，培养周期为30 d左右。 培养过程中每周至少检查1次，发现污染应立即剔除；在下次继代前记录增殖倍数。 10 壮苗培养 对生根培养前高度小于2cm 的瓶苗，可进行一次壮苗培养。其它操作见本标准第9章。 3 DB11/T 1648—2019 11 生根培养 将高度为2.0cm～3.0cm的单芽转接到生根培养基上，直径7.5 cm～8 cm、容积350 mL～370 mL的培 养瓶中可转接10株/瓶左右。其它操作见本标准第9章。 12 移栽过渡 12.1 移栽前准备 宜选择温度、光照、湿度可调控的温室作为移栽过渡的场所。移栽前应对环境进行消毒，消毒方法 参见附录C。 宜选择草炭和蛭石作为基质。在容器中先装入1/2草炭，上面再铺一层蛭石，用0.5 g/L的多菌灵溶 液将基质浇透后备用。 12.2 移栽 12.2.1 将长出 3～5 条不定根的瓶苗从培养容器中取出，放入清水中洗去培养基，沥水后进行移栽。 12.2.2 移栽时在基质上打孔，孔距 2cm 左右，孔大小以可容纳组培苗根系为宜。将根系植入孔内，覆 土至组培苗根颈处，稍压实，保持苗不倾斜。 12.2.3 栽好后插上牌子，写明品种和移栽日期。 12.3 管理 12.3.1 温室内温度宜控制在 20℃～28℃。 12.3.2 移栽后 2 周内相对湿度宜控制在 90%左右，移栽后 3～4 周可逐渐降低相对湿度，4～6 周后相 对湿度可保持在 60%左右。 12.3.3 移栽后 4 周内光照强度宜为 4000 Lux～7000 Lux，之后可逐渐增大光照强度至自然光。 12.3.4 每周喷施 80%多菌灵可湿性粉剂 1500 倍液 1 次，于苗上方 15 cm 处均匀悬挂诱虫板。 4 DB11/T 1648—2019 附 录 A （资料性附录） MS培养基成分和含量 MS培养基成分和含量见表A.1。 表 A.1 名称 MS 培养基成分和含量 MS 培养基成分 含量 （mg/L） 硝酸钾 KNO3 1 900 硝酸铵 NH4NO3 1 650 氯化钙 CaCl2·2H2O 440 硫酸镁 MgSO4·7H2O 370 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 铁 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 37.3 盐 硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 27.8 硫酸锰 MnSO4·4H2O 22.3 硫酸锌 ZnSO4·7H2O 8.6 硼 H3BO3 6.2 碘化钾 KI 0.83 钼酸钠 NaMoO4·2H2O 0.25 硫酸铜 CuSO4·5H2O 0.025 氯化钴 CoCl2·6H2O 0.025 肌 醇 C6H12O6 100 有 甘氨酸 C2H5NO2 2.0 机 烟 C6H5NO2 0.5 物 盐酸吡哆辛（VB6） C8H11NO3-HCl 0.5 盐酸硫胺素（VB1） C12H17ClN4OS-HCl 0.1 大 量 元 素 微 量 元 素 酸 酸 5 DB11/T 1648—2019 附 录 B （资料性附录） 组培各阶段的培养基配方 组培各阶段的培养基配方见表B.1. 表 B.1 组培各阶段的培养基配方 用 途 基本培养基 芽诱导培养基 MS 6-BA NAA 糖 琼脂 （mg/L） （mg/L） （g） （g） 0.5 0 30 6.0 注意事项 宜用不透 气膜封瓶 增殖培养基 MS 0.5～1.0 0～0.1 30 6.0 壮苗培养基 MS 0～0.5 0.1～0.2 30 6.0 口 宜用透气 膜封瓶口 生根培养基 1/2MS 2 0 2 0.5～1.0 琼脂的强度为 401 g/cm ～ 800 g/cm ； 壮苗培养基中加活性炭 1.0 g/L 。 6 20 6.0 DB11/T 1648—2019 附 录 C (资料性附录） 温室环境的消毒方法 温室环境的消毒方法见表C.1。 表 C.1 温室环境的消毒方法 名称 消毒方法 将地面绿苔、床下和床面的基质以及周边杂草等清理干净，宜使用 5%的漂白粉溶液喷洒地面及床面； 温室环境 2 2 可利用 10%百菌清烟剂 200 g/667m ～300 g/667m 作熏蒸处理。 完成上述化学消毒处理后，封闭温室进行 10 d～14 d 消毒处理。 _________________________________ 7