玉米抗镰孢菌根腐病鉴定技术规程

ICS 65.020 CCS B 05 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3357—2022 玉米抗镰孢根腐病鉴定技术规范 Technical specification on evaluation of maize resistance to Fusarium root rot 2022 - 01 - 28 发布 2022 - 02 - 28 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 3357—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：吉林省农业科学院。 本文件主要起草人：苏前富、贾娇、张伟、孟玲敏、白雪、王巍巍、高月波、王义生、晋齐鸣。 I DB22/T 3357—2022 玉米抗镰孢根腐病鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了玉米抗镰孢根腐病鉴定技术方法和抗性评价标准。 本标准适用于栽培玉米（Zea mays L.）自交系和杂交种等种质资源对玉米镰孢根腐病抗性的人工 接种鉴定及评价。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 镰孢根腐病 Fusarium root rot 由镰孢属的一些种（Fusarium spp.，有性态为赤霉属 Gibberella spp.）所引起的玉米苗期根部 病害。 4 镰孢菌接种体 分离、鉴定和保存 以常规组织分离法和单孢分离法（见附录 A）从田间采集的具有典型玉米根腐病症状的根部分离获 得纯培养物，依据形态特征和分子鉴定结果，明确其镰孢属种级分类地位（见附录 B）， 4 ℃ 保存备 用。 制备 挑取 4.1 保存的镰孢菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 25 ℃ 暗培养 5 d～7 d 后，用 无菌打孔器打取菌落边缘直径 5 mm 的菌饼，将其接种于合成低营养（SN）培养基中 150 r/min 摇培 7 6 d～10 d，镜检分生孢子浓度达到 1×10 个/mL 后，充分摇匀接种于经高压灭菌的高粱粒上，每 120 g 高粱粒接种 1 mL 孢子悬浮液，充分混匀， 25 ℃ 培养 7 d～10 d 后，待菌丝布满高粱粒，阴干低温 保存备用。PDA、SN 和高粱粒培养基配方见附录 C。 5 鉴定圃 设置 鉴定圃应具备良好的自然发病环境和排灌设施，周边应设置保护行。鉴定圃确定后不应随意更换。 1 DB22/T 3357—2022 试验设计 鉴定圃中每 2 行 (行长 5 m，行距 0.6 m～0.7 m ) 为一个小区，随机排列或顺序排列。每 30 行～ 50 行鉴定材料设 1 组对照材料（高抗自交系吉 842、高感自交系 LN 810），见附录 D。 种植要求 根据鉴定材料生育期、土壤环境及气候条件等适当早播。每行播种 50 粒种子，精量点播。鉴定材 料出苗率低于 60% 时视为该材料鉴定无效。 6 接种 时期与方法 播种时将按 4.2 制备的接种体与种子同时施入播种穴中，每穴约 5 g 接种体。 田间管理 播种后镇压保墒，正常田间管理。播种后若遇持续干旱，应及时浇灌，保持土壤含水量 60%～70% 。 7 调查 时间 玉米 4 叶～6 叶 期进行调查，同批次接种材料应在同一天完成。 方法 全小区调查，以玉米主胚根 2/3 以上发生腐烂为发病植株。记录每份鉴定材料的总株数和发病株 数,计算发病株率。按公式（1）计算发病株率： 𝑛 P = 𝑁 × 100 ······································································ （1） 式中： P——发病株率，单位为百分率（%）； n——发病株数，单位为株； N——调查总株数，单位为株。 病情分级 病情分级及相对应的植株发病株率描述见表 1。 表1 玉米对镰孢根腐病抗性鉴定的病情级别划分 病情级别 2 描 1 发病株率 0%～10%； 3 发病株率 10.1%～20%； 5 发病株率 20.1%～ 40.0%； 述 DB22/T 3357—2022 表1 玉米对镰孢根腐病抗性鉴定的病情级别划分（续） 病情级别 描 7 发病株率 40.1%～60.0%； 9 发病株率 60.1%～100%。 述 8 抗性评价 有效性判别 当鉴定圃中高感对照材料达到表 1 中的 9 级，该批次材料苗期根腐病鉴定结果视为有效。 评价 8.2.1 依据鉴定材料发病程度（病情级别）确定其抗性水平，评价标准见表 2。 表2 玉米对镰孢根腐病抗性的评价标准 病情级别 抗 性 1 高抗 Highly resistant（HR） 3 抗 5 中抗 Moderately resistant（MR） 7 感 9 高感 Highly susceptible（HS） Resistant（R） Susceptible（S） 8.2.2 对材料抗病性进行鉴定，鉴定结果填入表 3。 表3 编 号 品种/种质名称 年玉米抗镰孢根腐病鉴定记录表 来 源 病情级别 发病株率（%） 抗性评价 鉴定地点： 接种镰孢菌分离物编号： 接种日期： 调查日期： 评价技术负责人（签字）： 年 月 日 3 DB22/T 3357—2022 重复鉴定 鉴定材料若初次鉴定表现为高抗、抗、中抗，翌年进行重复鉴定。 评价结论 综合两年评价结果，抗性以记载的最高病情级别为准，并依此结果对鉴定材料进行评价，形成评价 结论。 4 DB22/T 3357—2022 附 录 A （资料性） 镰孢菌分离方法 A.1 常规组织分离法 切取小块病健交界处组织，经表面消毒和灭菌水清洗过后，在适宜的培养基和生长条件下培育纯菌 丝的一种简易方法。 A.2 单孢分离法 3 用灭菌水将 SN 培养基培养的镰孢菌分生孢子悬浮液稀释为 1 ×10 个/mL 的溶液，然后吸取 200 μL 溶液均匀涂布于 PDA 培养基上，25 ℃ 黑暗培养 24 h 后，挑取萌发的单个分生孢子于新的 PDA 培 养基中，25 ℃ 暗培养。 5 DB22/T 3357—2022 附 录 B （资料性） 玉米镰孢根腐病病原菌 B.1 学名和形态描述 B.1.1 禾谷镰孢（无性态）/玉蜀黍赤霉菌（有性态） 无性态学名：Fusarium graminearum Schwabe 有性态学名：Gibberella zeae（Schwein.）Petch 无性态特征：大型分生孢子呈镰刀状，有隔膜 3 个～7 个，顶端钝圆或略微收缩，基部有明显的 足细胞，具有 3 个～4 个分隔的分生孢子大小为（25 µm～40 µm）×（2.5 µm～4 µm），具有 5 个～ 7 个 分隔的分生孢子大小为 （48 µm～50 µm） × （3 µm～3.5 µm）（图 B.1）；小型分生孢子极 少或无，无厚垣孢子。 有性态特征：子囊壳卵圆状，直径约 140 µm～250 µm；子囊长棒状，（60 µm～85 µm ）×（8 µm～ 11 µm），内含 8 个子囊孢子，（19 µm～24 µm）×（3 µm～4 µm）。 图B.1 禾谷镰孢的菌落形态和分生孢子形态 B.1.2 拟轮枝镰孢（无性态）/藤仓赤霉（有性态） 无性态学名：Fusarium verticillioides（Sacc.）Nirenberg 有性态学名：Gibberella fujikuroi（Sawada）Wollew. 无性态特征：小型分生孢子念珠状串生，无色，单胞，（5 µm～12 µm）×（2 µm～3 µm）（图B.1）； 大型分生孢子较少，无色，镰刀状，略弯，两端尖，3 个～5 个分隔，（15 µm～60 µm ）×（2 µm～ 5 µm）。 有性态特征：较少形成，子囊壳球状，直径 220 µm～300 µm；子囊长棒状，内含 8 个子囊孢子； 子囊孢子大小（14 µm～18 µm）×（4.5 µm～6 µm）。 6 DB22/T 3357—2022 图B.2 拟轮枝镰孢的菌落形态和分生孢子形态 B.2 镰孢菌的分子鉴定 特异性检测：针对镰孢菌脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic,DNA）中属和种的特异性序列，用特异 性引物进行扩增。特异性引物、扩增产物大小及扩增所需要的退火温度见表 B.1。 表B.1 禾谷镰孢、拟轮枝镰孢和镰孢属的特异性引物 检测真菌 引物 引物序列（5´–3´） FG1 TTGGTCTACAAATTTCCAATGTGCTG FG2 TTGGTCTAAGCGTCTGATAGCCATGT VER1 CTTCCTGCGATGTTTCTCC VER2 AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA ItsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA ItsR TTTAACGGCGTGGCCGC F.graminearum F.verticillioides Fusarium spp. 扩增片段（bp） 退火温度（℃） 557 55 578 56 431 58 7 DB22/T 3357—2022 附 录 C （资料性） 镰孢菌培养基配方 C.1 PDA 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar medium，PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g， 琼脂 18 g～20 g，蒸馏水 1000 mL。 C.2 SN 培养基 合成低营养培养基（ Spezieller Nährstoffarmer，SN ）：磷酸二氢钾 1 g，硝酸钾 1 g，七水 硫酸镁 0.5 g，氯化钾 0.5 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，蒸馏水 1000 mL。 C.3 高粱粒培养基 高粱粒浸泡 12 h，然后煮 30 min ～ 40 min，装入三角瓶中于 121 ℃ 下灭菌 1 h，后放入室温 冷却，备用。 8 DB22/T 3357—2022 附 录 D （资料性） 田间小区排列图 田间小区排列见图D.1。 最少 10 m 保护行 4 垄～6 垄 或 10 m 试验小区 保护行 4 垄～6 垄或 10 m 最少 10 m 图D.1 田间小区排列图 9