养殖水体中孔雀石绿残留量的测定液相色谱-串联质谱法

ICS 65.150 A 40 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 2952—2019 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 2019 - 03 - 25 发布 河北省市场监督管理局 2019 - 04 - 25 实施 发 布 DB13/T 2952—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由衡水市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北美创检测科技有限公司、衡水市食品药品检验检测中心、衡水市农业农村 局、衡水市人力资源和社会保障局。 本标准主要起草人：崔婧、耿春辉、梁勃、段培姿、高学琴、韩吉祥、马娜、王婧、李刚、胡世 军。 I DB13/T 2952—2019 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 警告―使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了养殖水体中孔雀石绿残留量液相色谱串联质谱测定方法的原理、试剂、仪器和设备、 测定步骤、结果计算、准确度和精密度。 本标准适用于养殖水体中孔雀石绿残留量的测定。 本标准的方法检出限为2 ng/L，定量限为6 ng/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品中的孔雀石绿用乙腈和二氯甲烷液液萃取，反相色谱柱分离，质谱检测器检测，内标法定量。 4 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682中规定的一级水。 4.1 乙腈(CH3CN,CAS 号：75-05-8),色谱纯。 4.2 二氯甲烷(CH2Cl2,CAS 号：75-09-2),色谱纯。 4.3 无水乙酸铵（C2H7NO2,CAS 号：631-61-8）,分析纯。 4.4 甲酸(CH2O2,CAS 号：64-18-6),色谱纯。 4.5 甲酸溶液（0.1 %）：准确吸取 1.00 mL 甲酸(4.4)于 1000 mL 容量瓶中，用水定容，摇匀，经 0.22 μ m 混合纤维素滤膜过滤，备用。 4.6 乙腈-甲酸混合溶液（5+95）：5 mL 乙腈（4.1）与 95mL 甲酸溶液(5.5)超声混合 5 min。 4.7 盐酸羟胺（HONH3Cl,CAS 号：5470-11-1）,分析纯。 4.8 盐酸羟胺溶液（0.25 g/mL），称取 25 g 盐酸羟胺(4.7)于 100 mL 烧杯中，用水溶解，转移到 100 mL 容量瓶中，用水定容，摇匀备用。 1 DB13/T 2952—2019 4.9 孔雀石绿(C23H25N2·C2HO4·0.5C2H2O4，CAS 号：2437-29-8) 标准品，纯度≥98 %。 4.10 氘代孔雀石绿 (C23H20D5N2·C6H2N3O7，CAS 号：1258668-21-1)标准品，纯度≥98 %。 4.11 孔雀石绿标准储备溶液（1000 mg/L），准确称取孔雀石绿标准品（4.9）10.0 mg 于 50 mL 烧杯 中，用乙腈溶解，转移到 10mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容。﹣18℃避光保存，有效期 3 个月。 4.12 氘代孔雀石绿标准储备溶液（1000 mg/L），准确称取氘代孔雀石绿标准品（4.10）10.0 mg 于 50 mL 烧杯中，用乙腈溶解，转移到 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容。﹣18℃避光保存，有效期 3 个 月。 4.13 孔雀石绿标准中间液（10.0 µg/L），准确吸取适量孔雀石绿标准储备溶液（4.11）于容量瓶中， 用乙腈逐级稀释配成 100.0 µg/L 和 10.0 µg/L 的工作溶液，﹣18℃避光保存，有效期 7 d。 4.14 氘代孔雀石绿标准中间液（100 µg/L），准确吸取氘代孔雀石绿标准储备溶液（4.12）于容量 瓶中，用乙腈逐级稀释配成 100 µg/L 的工作溶液，﹣18℃避光保存，有效期 7 d。 4.15 混合标准工作溶液配制，吸取孔雀石绿标准中间液（4.13）、氘代孔雀石绿标准中间液（4.14） 适量，用乙腈-甲酸混合溶液配制成 0.10 µg/L、0.50 µg/L、1.00 µg/L、2.00 µg/L、5.00 µg/L 系列 标准工作溶液，氘代孔雀石绿含量 2.00 µg/L。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱-质谱联用仪,配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2 天平，感量 0.01 mg。 5.3 旋转蒸发仪。 5.4 涡旋混合器。 5.5 超声波振荡器。 6 测定步骤 6.1 样品处理 6.1.1 吸取水样 50.00 mL，置于 250 mL 分液漏斗中。向分液漏斗中加入 20.0 µL 氘代孔雀石绿标 准中间液（4.14）、1.50 mL 盐酸羟胺溶液（4.8）振摇混匀。 6.1.2 加入 10.00 mL 乙腈（4.1）、25.00 mL 二氯甲烷（4.2），剧烈振摇 3 min，静置分层 10 min， 将下层溶液转移至 125 mL 梨形瓶中。 6.1.3 继续向分液漏斗中加入 10.00 mL 乙腈（4.1）、25.00 mL 二氯甲烷（4.2），剧烈振摇 3 min， 静置分层 10 min，合并下层溶液于上述 125 mL 梨形瓶中，于 42℃水浴中减压浓缩至近干。 6.1.4 向梨形瓶中加入 1.00 mL 乙腈-甲酸混合溶液（4.6），涡旋振荡 1 min、超声振荡 1 min，样 液经 0.22 µm 针孔式有机相滤膜过滤后供液相色谱-质谱联用仪测定。 6.2 空白试验 2 DB13/T 2952—2019 准确吸取 50.00 mL 不含孔雀石绿的水样，按样品处理步骤进行。 6.3 测定 液相色谱-串联质谱参考条件： a) 色谱柱，C18 柱， 100 mm×2.1 mm，粒径 2.6 µm； b) 流动相，乙腈-甲酸混合溶液（5.6），洗脱梯度参数见表 1； 表1 流动相梯度表 c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) 时间 乙腈 0.1 %甲酸溶液 min % % 0 5 95 1.0 5 95 6.0 90 10 8.0 90 10 8.5 5 95 10.0 5 95 流速，0.4 mL/min； 柱温，35℃； 进样量，5 µL； 离子源，电喷雾离子源，正离子模式； 扫描方式，正离子扫描； 电喷雾电压，5500 V； 雾化气压力，55.0 psi； 气帘气压力，55.0 psi； 辅助气压力，60.0 psi； 离子源温度，600℃； 采集方式，多反应监测（MRM）； 监测离子对，孔雀石绿 m/z 329/313（定量离子）、329/208； 氘代孔雀石绿 m/z 334/318。 6.4 定性依据 在同样测试条件下，试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化 范围应在±2.5 %之内。被测试样中目标物的保留时间与相应标准的保留时间相比较, 相对误差应在± 2.5 % 之内。目标化合物的质谱定量和定性离子均出现, 而且同一检测批次, 对同一化合物,样品中目 标化合物的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的标准溶液相比, 其允许偏差不超过表 2规定的范围, 则可判断样品中存在目标物。 表 2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分率 相对离子丰度 ＞50 20～50（含） 10～20（含） ≤10 允许相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 6.5 定量测定 通过标准曲线计算制备液中孔雀石绿的浓度。 3 DB13/T 2952—2019 7 结果计算 所得实验数据按公式(1)计算。 Xi =   V1 V2 ………………………………………………(1) 式中： Xi—样品中孔雀石绿的含量，单位为微克每升(µg/L)； ρ—制备液中孔雀石绿的浓度，单位为微克每升(µg/L)； V1—最终定容体积，单位为毫升（mL）； V2—样品体积，单位为毫升（mL）。 平行测量结果用算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。 8 准确度和精密度 8.1 重复性 在重复条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过这两个测定值的算术平均值的10 %。 8.2 再现性 在再现条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过这两个测定值的算术平均值的15 %。 8.3 回收率 孔雀石绿添加浓度为6 ng/L～100 ng/L时，回收率为60 %～120 %。 _________________________________ 4