新型冠状病毒检测技术规范 第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品 
新型冠状病毒检测技术规范 第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品
ICS 13.100 C 50 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.17—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 17 部分：核酸检测用假病毒阳性质控品 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 17: Pseudovirus positive control material for nucleic acid detection 2021- 12 - 09 发布 江苏省市场监督管理局 2022 - 01 - 09 实施 发 布 DB32/T 3762.17—2021 目 前 次 言 ............................................................................................................................................................ II 1 范围 .............................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件 .......................................................................................................................................... 1 3 术语和定义 .................................................................................................................................................. 1 4 缩略语 .......................................................................................................................................................... 2 5 技术要求 ...................................................................................................................................................... 2 6 试剂和材料 .................................................................................................................................................. 3 7 仪器和设备 .................................................................................................................................................. 3 8 假病毒原液的技术要求 .............................................................................................................................. 3 9 质控品的制备 .............................................................................................................................................. 5 10 质控品的技术要求 ...................................................................................................................................... 5 I DB32/T 3762.17—2021 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定； ——第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序； ——第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序； ——第15部分：血清/血浆IgM和IgG抗体磁微粒化学发光法检测程序； ——第16部分：核酸数字PCR法； ——第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品； ——第18部分：规模化核酸检测程序。 本文件为DB32/T 3762 的第17部分。 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：南京市计量监督检测院、江苏省疾病预防控制中心、苏州市疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：林婧、朱立国、林学勇、胡宁、胡啟龙、王尚君、范宇宸、朱文、张雨晨、洪 捷、谈忠鸣、夏瑜、樊欢、邓斐。 II DB32/T 3762.17—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 17 部分：核酸检测用假病毒阳性质控品 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒核酸检测用假病毒类弱阳性质控品的术语和定义、缩略语、试剂和材料、 仪器和设备、假病毒原液的技术要求、质控品的制备和质控品的技术要求。 本文件适用于新型冠状病毒核酸检测用假病毒类弱阳性质控品的技术要求以及评价方法。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 JJF 1006 一级标准物质技术规范 JJF 1343 标准物质定值的通用原则及统计学原理 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 质控品 control material 用于体外诊断的质量控制物质，是一种旨在用于医学用途的检测系统中使用的物质、材料、物品或 设备，其目的是评价或验证测量精密度、测量准确度、由于试剂或分析仪器的变化检测系统可能产生的 分析偏差等性能特征，可用于能力验证、实验室内质量控制。 3.2 假病毒 pseudovirus 一种具有病毒拟似的物理结构和特异性核酸序列的病毒样粒子，其分析特性与真实病毒相似，但不 具备自我复制和感染的能力。 3.3 假病毒质控品 pseudovirus control material 由假病毒原料定量分装后制成，能够参与到病毒检测从提取到扩增的全过程；具有生物安全性的同 时可作为测量标准，用于病毒核酸定性和定量测量方法的验证评价以及实验室的质量控制。 3.4 计量溯源性 metrological traceability 1 DB32/T 3762.17—2021 通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准 （通常是与国家测量标准或国际测量标准）联系起来的特性。 3.5 同源性 homology 两个核酸分子的核苷酸序列间的相似程度。本文指假病毒质控品中目的基因序列与相应的真实病毒 参考毒株序列的一致性。 3.6 均匀性 uniformity 同一批次生产的假病毒质控品，每个最小包装单元含有等量的目标假病毒的状态。通过测量取自不 同包装单元或取自同一包装单元的、特定量的样品，定量测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为 质控品所含目标假病毒的量是均匀的。 3.7 稳定性 stability 假病毒质控品在特定的保存条件和保存时间内，假病毒的量保持在规定范围内的能力。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DMEM ：Dulbecco改良培养基（Dulbecco’s modified eagle’s medium） PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） qPCR ：荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction） RT-PCR ：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） RT-qPCR ：逆转录荧光定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction） RNase ：核糖核酸酶（ribonuclease） 5 技术要求 5.1 假病毒质控品的技术要求主要分为两个方面，包含对假病毒原液的技术要求，如假病毒内靶标 RNA 序列的同源性、假病毒原液的杂质残留等；还包含对质控品成品的技术要求，如靶标 RNA 定值、 均匀性、稳定性等。 5.2 假病毒质控品必须同时满足以下 8 点技术要求，才能作为新型冠状病毒核酸检测用的弱阳性质控 品： a) b) c) d) 用于制备质控品的原料假病毒含有与新冠核酸检测的靶标 RNA 序列一致的 RNA ； 用于制备质控品的假病毒原液不含有 cDNA 杂质； 用于制备质控品的假病毒原液无菌； 质控品的靶标 RNA 浓度为试剂盒检出限的 1.5-3 倍左右，且定值结果具有计量溯源性； 2 DB32/T 3762.17—2021 e) f) g) 质控品同批次均匀性合格； 质控品短期、长期及极端环境下稳定性合格； 质控品适用于至少 8 款获批上市的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。 6 试剂和材料 6.1 无酶水：GB/T 6682 中的一级水，应为无 RNA 酶的水。 6.2 PCR 、RT-PCR 、RT-qPCR 、数字 PCR 相关试剂：商品化试剂。 6.3 PCR 引物、探针：参照权威机构公布的序列或自行设计。 6.4 RNase ：商品化试剂。 6.5 无 RNA 酶的各型号枪头、EP 管、PCR 管、离心管、试管：商品化耗材。 6.6 本文件中所有的化学试剂，除特别说明外，全部为分析纯级别试剂。 7 仪器和设备 7.1 生物安全柜。 7.2 普通离心机、冷冻离心机。 7.3 恒温水浴锅。 7.4 PCR 仪。 7.5 核酸电泳仪。 7.6 凝胶成像系统。 7.7 荧光定量 PCR 仪。 7.8 数字 PCR 系统。 7.9 各型号移液器。 7.10 培养箱。 8 假病毒原液的技术要求 8.1 靶标 RNA 序列同源性的检测 8.1.1 检测方法 8.1.1.1 RT-PCR 检测 提取假病毒的 RNA 作为模板。选用中国疾病预防控制中心或世界卫生组织推荐的（见表 1）或根 据靶标 RNA 自行设计的引物进行 RT-PCR 扩增。设置以水为模板的阴性对照，以含靶标 RNA 的标 准物质为模板的阳性对照。扩增产物经电泳分离、回收反应产物。 3 DB32/T 3762.17—2021 表1 中国疾病预防控制中心、世界卫生组织推荐的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列 目标基因 ORF1ab N E 引物/探针序列（5’—3’） F CCCTGTGGGTTTTACACTTAA R ACGATTGTGCATCAGCTGA P 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' F GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT R CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG P 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' F ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT R ATATTGCAGCAGTACGCACACA P 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3' 8.1.1.2 测序及溯源性分析 将 8.1.1.1 的产物测序。测序结果与相应的新型冠状病毒核酸检测靶标 RNA 的参考序列进行比 对。 8.1.2 结果判定 在 RT-PCR 阴性对照和阳性对照都成立的情况下： a) 若满足假病毒 RNA 的 RT-PCR 产物的电泳结果为阳性且测序结果比对一致，则为合格； b) 若假病毒 RNA RT-PCR 产物的电泳结果为阴性，则表明假病毒未包裹病毒 RNA ，或假病毒 核酸提取失败，应重新制备假病毒或提取核酸。 8.2 cDNA 杂质的检测 8.2.1 检测方法 分别以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的 RNA 为模板，使用推荐的或自行设计的引 物和探针或商品化试剂盒进行 qPCR 扩增。设置以水为模板的阴性对照，以重组质粒为模板的阳性对 照。 8.2.2 结果判定 在阴性对照和阳性对照都成立的情况下： a) 若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的 RNA 的 qPCR 结果为阳性，即出现典型的 S 型 扩增曲线或依据试剂盒说明书判定，则表明原液中或假病毒内含有 cDNA 杂质，即为不合格， 应重新消化去除 cDNA 杂质。 b) 若未提取的假病毒原液和假病毒提取的 RNA 的 qPCR 结果为阴性，即未起峰或依据试剂盒 说明书判定，说明无 cDNA ，即为合格。 8.3 无菌检测 用 DMEM 培养基 37 ℃培养假病毒原液 24 h，溶液澄清，无菌生长，即为合格。 9 质控品的制备 4 DB32/T 3762.17—2021 对结果判定为合格的假病毒原液，根据需要使用适当的溶剂对假病毒原料进行稀释后，分装至冻存 管，直接或冻干后 -20 ℃保存。具体制备过程本文件不作赘述。 10 质控品的技术要求 10.1 新型冠状病毒靶标 RNA 的定量 10.1.1 基本要求 采用核酸提取方法提取假病毒质控品的 RNA ，采用 RT-qPCR 法或数字 PCR 法对靶标 RNA 的浓度进行定值。使用推荐的或自行设计的引物和探针或商品化试剂盒进行定值。核酸提取方法和靶标 RNA 浓度的定值方法均应通过适宜的国家有证标准物质的验证方可采用。 10.1.2 RT-qPCR 定量法 10.1.2.1 使用 RT-qPCR 法进行定量时，所使用的具体方法应为针对新型冠状病毒靶标 RNA 片段 设计建立的方法。 10.1.2.2 标准品可以为拷贝数已知的新型冠状病毒 RNA 或 cDNA ，或含有相关目的 DNA 片段的 重组质粒。 10.1.2.3 将标准品以 10 倍进行梯度稀释至少 5 个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液作为模板， 进行 RT-qPCR 反应，根据各梯度标准品的 Ct 值和浓度制定标准曲线和公式。 10.1.2.4 根据质控品 RNA 的 Ct 值，利用标准曲线和公式计算出质控品中新型冠状病毒靶标 RNA 的浓度。 10.1.3 数字 PCR 定量法 10.1.3.1 使用数字 PCR 法进行定量时，所使用的具体方法应为针对新型冠状病毒靶标 RNA 片段设 计建立的方法。 10.1.3.2 提取假病毒 RNA ，上样至数字 PCR 反应体系，进行数字 PCR 反应。按照式（1）计算质 控品 RNA 的浓度。 C C1 A （1） B C—质控品中靶标 RNA 的原始浓度，单位为拷贝每微升； C1—数字 PCR 检测结果所示的靶标 RNA 的浓度，单位为拷贝每微升； A—数字 PCR 反应体系中靶标 RNA 的稀释倍数； B—核酸提取时靶标 RNA 的浓缩倍数。 10.1.4 靶标 RNA 浓度的计算 定值结果采取 10.1.2 或 10.1.3 所述的方法进行靶标 RNA 的浓度计算，质控品浓度为新冠核酸 检测试剂盒检出限的 1.5-3 倍左右即为合格。 10.2 均匀性检测 10.2.1 检测方法 5 DB32/T 3762.17—2021 按照JJF 1006 和JJF 1343 的要求，依据每一批次质控品的制备数量，随机抽样选择不同数量的包 装单元进行均匀性检测。对质控品进行核酸提取后，按 10.1.2 或 10.1.3 的方法进行靶标 RNA 浓度 测定，计算每一个包装单元靶标 RNA 的浓度。 10.2.2 均匀性判定 对所得数据按照 JJF 1006 和 JJF 1343 的统计学要求进行检验，若结果无显著性差异，则质控品 均匀性良好，即为合格。若存在显著性差异，即为均匀性不合格。 10.3 稳定性检测 10.3.1 短期稳定性 短期稳定性评价质控品在使用温度（20±5）℃和运输温度 4 ℃下的稳定性。按 JJF 1006 和 JJF 1343 的方法进行评价。按 10.1.2 或 10.1.3 的方法进行靶标 RNA 浓度测定。 10.3.2 长期稳定性 长期稳定性评价质控品在存储温度 -20 ℃的稳定性。按 JJF 1006 和 JJF 1343 的方法进行评价。按 10.1.2 或 10.1.3 的方法进行靶标 RNA 浓度测定。 10.3.3 Rnase 耐受性检测 Rnase 耐受性评价质控品暴露于极端高浓度 Rnase 环境下的稳定性。根据 Rnase 的使用说明书进 行质控品的孵育。孵育后的质控品，按 10.1.2 或 10.1.3 的方法进行靶标 RNA 浓度测定。 10.3.4 稳定性判定 10.3.4.1 对不同时间点或 Rnase 处理前后所得质控品靶标 RNA 浓度的数据按照 JJF 1006 和 JJF 1343 的统计学要求进行检验。若无显著性差异，说明稳定性良好，即为合格。若存在显著性差异，说 明对应条件下稳定性不合格。 10.3.4.2 质控品在（20 ±5）℃使用温度下应至少稳定 3 h ，在 4 ℃运输温度下至少稳定 1 个月， 在 -20 ℃存储温度下至少稳定 6 个月，RNase 处理 1h 后稳定性应符合要求。 10.4 适用性验证 用获批上市的新型冠状病毒核酸检测试剂盒验证质控品的适用性。按照试剂盒说明进行操作和结果 判定，结果为阳性即为适用。质控品适用于至少 8 款获批上市的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，即为 合格。 _________________________________ 6