规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程

ICS 11.220 CCS B 41 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4460—2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性 腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧 光定量 RT-PCR/PCR 检测技术规程 Real-time fluorescence quantitative RT-PCR/PCR detection technique for foot-and-mouth disease virus, bovine viral diarrhea virus and infectious bovine rhinotracheitis virus in aerosol of large-scale cattle farms 2021-12-27 发布 2022-01-27 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 4460—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 I DB37/T 4460—2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻 气管炎病毒实时荧光定量 RT-PCR/PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒荧光定 量RT-PCR/PCR检测技术。 本文件适用于畜舍环境及疫区环境气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病 毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 FMD：口蹄疫 FMDV：口蹄疫病毒 BVDV：牛病毒性腹泻病毒 IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒 PCR：聚合酶链式反应 RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应 DNA：脱氧核糖核酸 RNA：核糖核酸 cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA AGI：全玻璃液体冲击式采样器 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 1 DB37/T 4460—2021 5.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 要求。所用液体试剂均需 使用无 DNA/RNAase 的容器进行分装。 5.2 体积比 25:24 的酚：氯仿溶液，应 2 ℃～8 ℃保存见 A.1。 5.3 体积比 24:1 的氯仿：异戊醇溶液，应 2 ℃～8 ℃保存见 A.2。 5.4 0.1 % DEPC 水。 5.5 无水乙醇，应-20 ℃预冷。 5.6 75 % 乙醇，配置见 A.5，应-20 ℃预冷。 5.7 TE 缓冲液，配制见 A.6。 5.8 2 mol/L NaAc 溶液，配制见 A.7。 5.9 阳性、阴性对照。 ——阳性对照：分别为带有 FMDV 5′-UTR 基因、BVDV 5′-UTR 基因和 IBRV gD 基因的质粒，制备见附 录 B。 ——阴性对照：分别为已知 FMDV、BVDV 阴性气溶胶样本的 cDNA 和 IBRV 阴性气溶胶样本 DNA。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 空气微生物采样箱。 荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 高速冷冻离心机，最高转速应不低于 13 000 r/min。 冰箱，2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种。 微量移液器及配套吸头，量程规格应包含 5 L、10 L、100 L 和 1 000 L。 1.5 mL 离心管，应无 DNAase 和 RNAase。 电热恒温水槽（室温至 100 ℃）。 涡旋振荡器。 天平（精密度千分之一以上）。 Ⅱ级生物安全柜 A 型。 7 气溶胶样品 7.1 气溶胶样品的采集、灭活处理 应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。样品采集后立即用1 %甲醛溶液灭活处理。 采集方法与注意事项应按照附录C。 7.2 样品贮运 样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封， 24 h内送实验室。 7.3 样品保存 样品在2 ℃～8 ℃条件下保存不应超过24 h，若长期保存应置-70 ℃以下，应避免反复冻融（冻融不 超过三次）。 8 实验步骤 2 DB37/T 4460—2021 8.1 实验室规范 荧光RT-PCR检测方法的实验室规范应符合GB 19489和GB/T 27401要求，整个实验过程中均须使用无 DNAase/RNAase的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250 ℃干烤4 h以上，以彻底去除DNAase/RNAase。 8.2 样品病毒核酸 RNA 和 DNA 提取 所提取物为气溶胶采集液，可能含有病毒。操作者必须带口罩和一次性手套，RNA提取尽量在人少 时进行，防止空气中RNAase的污染。所用物品也应无RNAase。 8.2.1 样品病毒核酸 RNA 提取 8.2.1.1 在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，再加入 TRIzol 1 mL，充分混匀，室温放置 10 min。 8.2.1.2 加入 200 μL 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相 现象），室温放置 10 min。 8.2.1.3 4 ℃离心、13 000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.1.5 离心 4 ℃、13 000 r/min、15 min，用枪小心吸去所有上清。 8.2.1.6 加 1 mL 75 %乙醇洗一遍，离心 4 ℃、8 000 r/min、10 min，用枪小心吸去所有上清，重复此 步骤，在超净台中干燥 5 min。 8.2.1.7 加入 50 μL TE 缓冲液溶解 RNA，-20 ℃保存备用。 8.2.1.8 可采用经验证的病毒 RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 RNA。 8.2.2 样品病毒核酸 DNA 提取 8.2.2.1 在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，加入 450 μL 裂解缓冲液，再加入 20 μL 蛋 白酶 K，充分混匀，55 ℃ 15 min。 8.2.2.2 加入 700 μL 的酚：氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无 分相现象），室温放置 10 min。 8.2.2.3 13 000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.2.4 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.2.5 13 000 r/min、15 min，取上清液相移入另一管。 8.2.2.6 加入 1/10 体积 2 mol/L NaAc 和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室 温放置 10 min。 8.2.2.7 13 000 r/min、5 min，用枪小心吸去上清，加 1 mL 75 %乙醇洗一遍，8 000 r/min、10 min， 用枪小心吸去所有上清，重复此步骤，在超净台中干燥 5 min。 8.2.2.8 加入 50 μL TE 缓冲液溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 8.2.2.9 可采用经验证的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA。 8.3 实时荧光定量 RT-PCR/PCR 扩增 8.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+2管阳性对照），每个测试 反应体系需要20 μL荧光RT-PCR反应液。根据所检测的病毒选择引物，见表D.1。按D.2配制反应液，为 避免移液器取样损失，建议按n+1个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分 混合均匀后，向每个PCR管中各分装20 μL，转移至样品处理区。 3 DB37/T 4460—2021 8.3.2 加样 在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤7.2.1.7中制备的RNA溶液5 μL和 7.2.2.8中制备的DNA溶液2 μL，盖紧管盖，500 r/min 离心30 sec，转移至检测区。 8.3.3 实时荧光定量 RT-PCR 反应 在检测区进行，选择检测模式：SYBR Green I。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。 反应参数设置：第一阶段，反转录42 ℃/15 min；第二阶段，预变性95 ℃/30 sec；第三阶段，94 ℃/15 sec，61 ℃/30 sec，40个循环。最后40 ℃ 2 min。荧光收集在第三阶段每次循环的61 ℃延伸时进行。 可根据不同品牌PCR仪器说明书等效设置参数。 8.3.4 实时荧光定量 PCR 反应 在检测区进行，选择检测模式：SYBR Green I。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。 反应参数设置：第一阶段，预变性94 ℃/3 min；第二阶段，94 ℃/15 sec，61 ℃/30 sec，40个循环。最 后40 ℃ 2 min。荧光收集在第二阶段每次循环的61 ℃延伸时进行。可根据不同品牌PCR仪器说明书等效 设置参数。 9 结果判定 9.1 结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为 准。 9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 9.2.2 阳性对照的 Ct 值应小于等于 28，并出现典型的扩增曲线。 9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无FMDV、BVDV、IBRV核酸。 9.3.2 阳性 若检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤30.0，表示相应管内样本中分别存在FMDV、BVDV、IBRV 核酸。 9.3.3 可疑 若检测通道Ct值在30.0～38.0区间，且出现典型的扩增曲线的样品，建议复验。复验仍出现上述结 果的，判为阳性，否则判为阴性。 4 DB37/T 4460—2021 A A 附 录 A （资料性） 溶液配制 A.1 体积比 25：24 的酚：氯仿溶液 取Tris-饱和酚有机相（下层溶液）50 mL和氯仿48 mL混匀，2 ℃～8 ℃保存。 A.2 体积比 24:1 的氯仿：异戊醇溶液 取氯仿48 mL和异戊醇2 mL混匀，2 ℃～8 ℃保存。 A.3 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液 称取6.055 g Tris置于100 mL烧杯中，加入80 mL 0.1 %DEPC水，用浓HCl调节pH值至8.0，定容至100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.4 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液 称取18.61 g Na2EDTA·2H2O置于100 mL烧杯中，加入80 mL 0.1 % DEPC水，用10 %的NaOH溶液，调节 pH值至8.0，定容至100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.5 75 % 乙醇 量取75 mL 无水乙醇，加入25 mL 0.1 % DEPC水。 A.6 TE 缓冲液 将0.5 mL的10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)、0.1 mL的0.5 mol/L EDTA(pH8.0)加入到容量瓶中，调pH8.0， 加0.1 % DEPC水定容至50 mL，高压灭菌后，降至室温，4 ℃保存。 A.7 2 mol/L NaAc（PH 5.2）溶液 称量16.4 g无水NaAc置于100 mL烧杯中，加入约40 mL的去离子水搅拌溶解；加入冰醋酸调节PH至5.2， 加去离子水将溶液定容至100 mL。 5 DB37/T 4460—2021 B B 附 录 B （资料性） 阳性质粒标准品的制备 B.1 引物 引物序列表见表B.1。 表B.1 引物序列表 病毒名称 口蹄疫病毒 牛病毒性腹泻病毒 牛传染性鼻气管炎病毒 序列名称 序列（5’-3’ ） 上游引物 CGTTGCACTCCACACTTAC 下游引物 GACCAAGTAGGCGGAAAG 上游引物 ATGACACAGGAAAACATTCCGG 下游引物 CTTCGGTTTGACATCATACACAC 上游引物 GGGCGACTAGAGATACACTCGCC 下游引物 GTTTCGAGAACCAGCAGTCC B.2 PCR 反应液配方 PCR反应液配方见表B.2。 表B.2 PCR 反应液配方 口蹄疫病毒 组分 牛传染性鼻气管炎病毒 1 个反应体系的加入量 2+ 10×LA Buffer（Mg Plus） 2×GC Buffer（Mg 牛病毒性腹泻病毒 2+ 5.0 μL 5.0 μL Plus） 25.0 μL 2.5 mM dNTPs 8.0 μL 8.0 μL 8.0 μL 5 U/μL LA Taq 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 口蹄疫病毒上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 口蹄疫病毒下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛病毒性腹泻病毒上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛病毒性腹泻病毒下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛传染性鼻气管炎病毒上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛传染性鼻气管炎病毒下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 灭菌超纯水 33.5 μL 口蹄疫病毒 cDNA 2.0 μL 牛病毒性腹泻病毒 cDNA 33.5 μL 2.0 μL 牛传染性鼻气管炎病毒 DNA 合计 13.5 μL 2.0 μL 50 μL 50 μL 50 μL B.3 口蹄疫病毒阳性质粒标准品的制备 取 已 加 入 TRIzol 的 口 蹄 疫 病 毒 细 胞 培 养 物 200 μ L ， 参 照 7.2.1 提 取 病 毒 RNA ， RNA 按 照 TM FermentasRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录cDNA。以cDNA为模板进行 PCR扩增，PCR反应液见表B.2。反应参数设置：第一阶段，95 ℃/5 min；第二阶段，94 ℃/15 sec，58 ℃ 6 DB37/T 4460—2021 /30 sec，72 ℃/30 sec，33个循环；第三阶段，72 ℃/5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的 片 断 后 克 隆 至 pEAST-T3 载 体 ， 蓝 白 斑 筛 选 重 组 质 粒 ， 进 行 DNA 测 序 ， 将 测 序 结 果 在 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 网 站 进 行 BLAST 比 对 ， 正 确 的 重 组 质 粒 命 名 为 pEAST-T3-FMDV，作为检测口蹄疫病毒的阳性质粒标准品。 B.4 牛病毒性腹泻病毒阳性质粒标准品的制备 TM 取牛病毒性腹泻病毒细胞培养物200 μL，参照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应液见 B.2。反应参数设置同B.3。PCR产物凝胶电泳、回收、pEAST-T3载体克隆、重组质粒筛选、DNA测序及测 序结果BLAST比对同B.3，正确的重组质粒命名为pEAST-T3-BVDV，作为检测牛病毒性腹泻病毒的阳性质 粒标准品。 B.5 牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒标准品的制备 取牛传染性鼻气管炎病毒的细胞培养物200 μL，参照7.2.2提取病毒DNA。以牛传染性鼻气管炎病 毒的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应液见B.2。反应参数设置同B.3。PCR产物凝胶电泳、回收、pEAST-T3 载体克隆、重组质粒筛选、DNA测序及测序结果BLAST比对同B.3，正确的重组质粒为阳性，将其命名为 pEAST-T3-IBRV，作为检测牛传染性鼻气管炎病毒的阳性质粒标准品。 7 DB37/T 4460—2021 C C 附 录 C （规范性） 牛场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项 C.1 采样环境 环境温度≥5 ℃。 C.2 试剂 0.9 %灭菌生理盐水和橄榄油。 C.3 仪器与耗材 空气微生物采样箱，Porton空气微生物采样器，三角支架，灭菌注射器（10 mL），一次性口罩， 一次性手套，一次性无菌隔离服。 C.4 采样人员要求 现场采样的工作人员要穿工作服和胶鞋、戴上口罩、防风眼镜和一次性乳胶手套，做好个人安全防 护。 C.5 采样工具 采集气溶胶用的气溶胶采样器、生理盐水分别包装并提前121 ℃高压灭菌消毒，并准备好充足的无 菌离心管、消毒的密封袋、一次性注射器、胶布、保温箱、记号笔等物品。使用前要仔细检查离心管、 密封袋，若有破损者不得使用。 C.6 气溶胶样品采样 设备安装：首先安装三脚架，空气微生物采样器放置高度为距地面1.5 m，将30 mL灭菌生理盐水注 入，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。橡胶连接管的一端接到空气微生物采样箱主机入 气口上，另一端连接到Porton空气微生物采样器的出气口上。 收集参数：采用液体冲击式采样方式，采样流量为12.5 L/min，采样时间为30 min。 收集标准：每个牧场一般在产房、动物房、运动场和奶厅4个位置分别采集2份样本。 样品的灭活处理与分装：气溶胶采样器采集结束后，直接将30 mL样本收集到50 mL离心管内，采样 器立即用70 %乙醇溶液灭活处理，放入密封袋封口。气溶胶采集液立即用1 %甲醛溶液灭活处理，盖好离 心管盖，胶布封口，然后装入密封袋封口，在离心管壁和密封袋上记录采样牛场、位置、采样时间、采 样人。将装有气溶胶样本的离心管竖直口朝上和冰袋一块放入保温箱，盖好盖子，胶带封口。派车专程 送往有条件的实验室进行荧光定量PCR检测，采集的两份样品，一份用于直接检测，另一份-20 ℃保存 用于复检。 样品运送：在样品运送过程中，装样品的保温箱不得倾倒，以防液体外溢。到达目的地后，对车体 应全面消毒。 C.7 采样现场用具处理 气溶胶现场采集完毕后，立即对空气微生物采样箱、三角支架用70 %乙醇溶液消毒。 8 DB37/T 4460—2021 D D 附 录 D （资料性） 引物序列及荧光 RT-PCR/PCR 反应液配方 D.1 引物 引物序列表见表D.1。 表D.1 引物序列表 病毒名称 序列（5’-3’ ） 上游引物 CGTTGCACTCCACACTTAC 下游引物 GACCAAGTAGGCGGAAAG 上游引物 TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA 下游引物 CCCTATCAGGCTGTATTCGT 上游引物 ACGGACGACGAGCTGGGACT 下游引物 CGGCAGCGAAACCATGAAAT 口蹄疫病毒 序列名称 牛病毒性腹泻病毒 牛传染性鼻气管炎病毒 D.2 荧光 RT-PCR 反应液配方 荧光RT-PCR/PCR反应液配方见表D.2。 表D.2 荧光 RT-PCR/PCR 反应液配方 组分 2×One Step SYBR Green RT-PCR Buffer 口蹄疫病毒 牛病毒性腹泻病毒 1 个检测体系的加入量 10.0 μL 10.0 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL ExTaq HS Mix 1.0 μL 1.0 μL PrimeScript PLUS RTase Mix 0.5 μL 0.5 μL 口蹄疫病毒上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 口蹄疫病毒下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛病毒性腹泻病毒上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛病毒性腹泻病毒下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL 牛传染性鼻气管炎病毒上游引物 0.5 μL (10 μmol/L) 牛传染性鼻气管炎病毒下游引物 0.5 μL (10 μmol/L) DEPC 水 2.5 μL 2.5 μL 样本 RNA 5.0 μL 5.0 μL 样本 DNA 合计 牛传染性鼻气管炎病毒 7.0 μL 2.0 μL 20 μL 20 μL 20 μL 9