水稻花药培养技术规程
水稻花药培养技术规程
ICS 65.020.01 B 05 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/ T 1290—2017 水稻花药培养技术规程 Technical regulations for anther culture of rice (报批稿) 2017 - 10 - 20 发布 湖北省质量技术监督局 2017 - 11 - 20 实施 发 布 DB42/T 1290—2017 目 次 前言 ............................................................................... III 引言 ................................................................................. V 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 3.1 水稻花药培养 4 rice anther culture ......................................... 1 水稻花药培养操作程序 .............................................................. 1 4.1 操作流程 ...................................................................... 4.2 培养基的配制 .................................................................. 4.2.1 配制程序 .................................................................. 4.2.2 母液的配制和保存 .......................................................... 4.2.3 培养基的类型 .............................................................. 4.2.4 配制方法 .................................................................. 4.3 水稻幼穗的准备 ................................................................ 4.3.1 取样 ...................................................................... 4.3.2 预处理 .................................................................... 4.3.3 消毒 ...................................................................... 4.4 取花药接种 .................................................................... 4.5 诱导愈伤组织 .................................................................. 4.6 愈伤组织分化 .................................................................. 4.6.1 愈伤组织转移 .............................................................. 4.6.2 分化培养 .................................................................. 4.7 生根 .......................................................................... 4.7.1 转移花培苗 ................................................................ 4.7.2 生根培养 .................................................................. 4.8 花培苗炼苗与移栽 .............................................................. 4.8.1 炼苗 ...................................................................... 4.8.2 移栽与管理 ................................................................ 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 附录 A（规范性附录） 培养基母液配制成分表 ............................................ 5 附录 B（资料性附录） 常用植物生长物质及配制方法 ...................................... 6 附录 C（规范性附录） 水稻花药培养培养基配方 .......................................... 7 I DB42/T 1290—2017 II DB42/T 1290—2017 前 言 本标准根据GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 免责申明：请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖北省农业科学院提出。 本标准由湖北省农业科学院归口管理。 本标准起草单位：湖北省农业科学院粮食作物研究所、湖北省农业科学院经济作物研究所、长江大 学。 本标准主要起草人：游艾青、李三和、陈志军、杨国才、周 雷、刘 凯、向发云、闸雯俊、徐华山、 李培德、田小海。 III DB42/T 1290—2017 IV DB42/T 1290—2017 引 言 水稻花药培养是现今比较广泛应用于水稻育种中的一项新的生物技术，通过花药培养可以快速纯合 育种材料、提高选择效率、有效缩短育种周期、能打破不利性状的连锁关系，扩大变异范围、准确筛选 突变体、丰富遗传研究材料、加速有效性状转移。主要应用于常规水稻育种、杂交稻亲本的提纯和选育、 水稻种质创新、永久性作图群体的构建以及转基因育种等方面。 在实际操作过程中，多种因素的影响，特别是人员操作的差异可能会导致完全不同的效果。为保证 水稻花药培养操作的规范性，更有效地服务于水稻育种和水稻其他方面的科学研究，特制定本标准。 V DB42/T 1290—2017 水稻花药培养技术规程 1 范围 本标准规定了水稻花药培养技术的操作程序要求。 本标准适用于水稻的花药培养。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB32/T 1848-2011 水稻转基因实验室安全操作规程 DB22/T 281-2001 真菌实验室的消毒灭菌方法 DB33/T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适应于本标准。 3.1 水稻花药培养 rice anther culture 水稻花药培养是用组织培养技术，把发育到一定阶段的水稻花药，采用无菌操作技术，接种在人工 培养基上，通过改变花药内花粉粒的发育程序诱导其脱分化，并连续进行有丝分裂形成细胞团，进而形 成一团无分化的薄壁组织——愈伤组织，随后使愈伤组织再分化成胚状体或分化成完整的水稻植株。 4 水稻花药培养操作程序 4.1 操作流程 水稻花药培养操作流程见图1。 培养基配制 取药接种 幼穗取样 低温预处理 诱导培养 分化培养 消毒 花培苗移栽 炼苗 生根培养 图1 水稻花药培养操作流程 1 DB42/T 1290—2017 4.2 培养基的配制 4.2.1 配制程序 准备好母液、蒸馏水、蔗糖、固化剂等，按图2的程序配制。 培养器皿 蒸馏水+母液+糖 pH 调整 洗涤 干燥 分装 固化剂 加热溶解 凝固 灭菌 封口 图2 培养基配制程序 4.2.2 母液的配制和保存 按大量元素、微量元素、铁盐、植物生长物质分别配制母液见附录A、附录B。母液配制好后，放 置于4℃的冰箱中保存。 4.2.3 培养基的类型 根据不同的培养阶段配制不同类型的培养基，见附录C。 4.2.4 配制方法 诱导培养基的配制（以配制1L培养基为例）：称取植物凝胶3g放置锅中，加入800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取N6大量元素I、II各50 mL，N6微量元素III、铁盐IV、 N6有机物V各10 mL于烧杯中，然后加入1 mg·L-1 KT 1mL、1 mg·L-1 NAA 3mL、1 mg·L-1 2, 4-D 2mL混 匀，并在母液混合液中加入600 mg脯氨酸使其溶解；凝胶完全融化后加入50 g蔗糖溶解，再将母液混合 液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至1L。混合时一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝固。混合均匀 后用精密pH试纸调节培养基pH值至5.8。趁热将培养基分装到100 mL三角瓶中，每瓶装30 mL~35 mL， 封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 分化培养基的配制（以配制1L培养基为例）：称取植物凝胶3 g放置锅中，加入800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取MS大量元素I、II各50mL，MS微量元素III、铁盐IV、 MS有机物V各10 mL于烧杯中，然后加入1 mg·L-1 6-BA 0.5mL、1 mg·L-1 KT 2mL、1 mg·L-1 NAA 0.5 mL 混匀；凝胶完全融化后加入30 g蔗糖溶解，再将母液混合液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至1L。混合时 一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝固。混合均匀后用精密pH试纸调节培养基pH值至5.8。趁热将 培养基分装到100 mL三角瓶中，每瓶装30 mL~35 mL，封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 2 DB42/T 1290—2017 生根培养基的配制（以配制1L培养基为例）：称取植物凝胶3 g放置锅中，加入800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取MS大量元素I、II各25mL，MS微量元素III、铁盐IV各 5mL、MS有机物V 10mL于烧杯中，然后加入1 mg·L-1 IBA 0.2mL混匀；凝胶完全融化后加入30g蔗糖， 再将母液混合液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至1L。混合时一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝 固。混合均匀后用精密pH试纸调节培养基pH值至5.8。在培养基中加入0.5g活性炭粉末搅匀，趁热将培 养基分装到100 mL三角瓶中，每瓶装30 mL~35 mL，封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 植物生长物质配制方法见附录B。 4.3 水稻幼穗的准备 4.3.1 取样 观察外部特征和碘-碘化钾染色法镜检核对，于晴天下午选取花药发育处于幼穗分化第七期的中后 期，即单核中晚期（单核靠边期）的幼穗（剑叶与下一叶的叶枕距约5 cm~10 cm，颖壳大部分已接近成 熟的大小，呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3~1/2）。 4.3.2 预处理 用75％酒精对带苞叶稻穗表面擦拭消毒，然后将稻穗用湿润纱布包裹，装入保鲜袋后贴上标签，注 明材料名称和取样时间等信息，置于冰箱中进行低温预处理。一般处理为8℃，8天~12天为宜。 4.3.3 消毒 将预处理后的稻穗剥除苞叶，剪取中部稻穗，用0.1%升汞溶液浸泡10 min或用新配制的3 %次氯酸 钠溶液浸泡25 min，之后用无菌水冲洗4次~5次，用无菌滤纸吸干水分。 4.4 取花药接种 在无菌操作台上，将颖壳基部1/5处剪断，用镊子夹住颖壳，剪口朝下，在三角瓶口敲动，将花药 抖落至诱导培养基上，每个100 ml三角瓶接种80个~100个花药。接种花药时不要剪断或碰伤花药。 4.5 诱导愈伤组织 将接种好的材料放至培养箱中暗培养（培养温度为籼稻30℃，粳稻28℃）至愈伤组织直径2 mm~3 mm。 4.6 愈伤组织分化 4.6.1 愈伤组织转移 3 DB42/T 1290—2017 在无菌操作台上挑取质地坚硬、淡黄色颗粒状的愈伤组织，转移至分化培养基上。每个100 ml三角 瓶中接4个~5个愈伤组织。 4.6.2 分化培养 材料放至培养箱中，培养条件为光照强度24μmol·m-2·s-1~36μmol·m-2·s-1，光照时长12 h·d-1~16h·d-1， 温度28℃，培养至长出3cm~5 cm的花培苗。 4.7 生根 4.7.1 转移花培苗 取生长健壮、叶色正常、完整的花培苗移植到生根培养基上，每个100 ml三角瓶中放置4个~5个花 培苗。 4.7.2 生根培养 将移植的花培苗放至培养箱中，直至小苗生出完整根系，苗粗壮，高度10cm以上。培养条件为光 照强度24μmol·m-2·s-1~36 μmol·m-2·s-1，光照时长12 h·d-1~16h·d-1，温度28℃。 4.8 花培苗炼苗与移栽 4.8.1 炼苗 将培养瓶放置日光温室，温度控制在25℃±3℃，打开瓶盖，加水至培养基上1cm，炼苗3d，然后 将根部培养基清洗干净，用静置过1 d~2 d的自来水继续养苗3 d~5 d，直至长出1 cm左右的新根。 4.8.2 移栽与管理 将长出新根的花培苗移栽至田面平整、泥融的秧田。干湿交替湿润水分管理，注意防止低温死苗和 高温烧苗。 4 DB42/T 1290—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基母液配制成分表 表A.1给出了培养基母液配制成分表的内容 。 表A.1 培养基母液配制成分表 培养基成分 大量元素 I（20×） 大量元素 II（20×） 微量元素 III（100×） 铁盐 IV（100×） 有机物 V（100×） MS N6 (NH4)2SO4 0 9260 NH4NO3 33000 0 KNO3 38000 56600 MgSO4·7H2O 7400 3700 KH2PO4 3400 8000 CaCl2·2H2O 8800 3320 MnSO4·4H2O 2230 446 ZnSO4·7H2O 860 150 H3BO3 620 160 KI 83 83 Na2MoO4·2H2O 25 0 CuSO4·5H2O 2.5 0 CoCl2·6H2O 2.5 0 Na2-EDTA 3730 3730 FeSO4·7H2O 2780 2780 VB1 40 100 烟酸 50 50 VB6 50 50 肌醇 10000 0 甘氨酸 200 200 -1 注：单位：mg·L 5 DB42/T 1290—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 常用植物生长物质 表B.1给出了常用植物生长物质的配制方法。 表B.1 常用植物生长物质 类 别 种类 -1 1 mg·L 母液配制方法 称取固体 100mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加边摇匀， 6-BA 细胞分裂素 -1 最后定容至 100mL，即为 1 mg·L 母液。 称取固体 100mg，将固体用 5mL 1mol·L KT -1 KOH 溶液预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边 -1 加边摇匀，最后定容至 100mL，即为 1 mg·L 母液。 称取固体 100mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加边摇匀， IBA -1 最后定容至 100mL，即为 1 mg·L 母液。 称取固体 100mg，将固体用 5mL 1mol·L 生长素 NAA -1 KOH 溶液预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边 -1 加边摇匀，最后定容至 100mL，即为 1 mg·L 母液。 称取固体 100mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加边摇匀， 2,4-D 6 -1 最后定容至 100mL，即为 1 mg·L 母液。 DB42/T 1290—2017 C 附 录 C （规范性附录） 水稻花药培养培养基配方。 表C.1给出了水稻花药培养基配方每升培养基用量内容。 表C.1 水稻花药培养培养基配方 诱导培养基 分化培养基 生根培养基 MS 大量元素 I 0 50mL 25mL MS 大量元素 II 0 50mL 25mL MS 微量元素 III 0 10mL 5mL MS 有机物 V 0 10mL 10mL 铁盐 IV 10mL 10mL 5mL N6 大量元素 I 50mL 0 0 N6 大量元素 II 50mL 0 0 N6 微量元素 III 10mL 0 0 N6 有机物 V 10mL 0 0 6-BA 0 0.5 mL 0 KT 1mL 2 mL 0 IBA 0 0 0.2 mL NAA 3 mL 0.5 mL 0 2,4-D 2mL 0 0 介质 植物凝胶 3g 3g 3g 碳源 蔗糖 50g 30g 30g 脯氨酸 600mg 0 0 活性炭 0 0 0.5g pH 值 5.8 5.8 5.8 适用培养阶段 诱导 分化 生根 激素 7 DB42/T 1290—2017 8 D