甲型H1N1流感病毒双抗体ELISA检测方法

ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 790—2012 甲型 H1N1 流感病毒双抗体 ELISA 检测方法 Method of the ELISA test for the detection of subtype A/H1N1 influenza virus 2012 - 01 - 06 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 03 - 01 实施 发 布 DB42/T 790—2012 目 次 前言................................................................................................................................................................... III 引言..................................................................................................................................................................... IV 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 缩略词............................................................................................................................................................. 1 3 实验原理......................................................................................................................................................... 1 4 实验条件......................................................................................................................................................... 1 5 实验材料......................................................................................................................................................... 1 6 样品处理......................................................................................................................................................... 2 7 实验方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 3 9 注意事项......................................................................................................................................................... 3 附录 A.................................................................................................................................................................... 4 I DB42/T 790—2012 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫 病预防控制中心。 本标准主要起草人：金梅林、钟广汉、赵刚、孙小美、李淑云、郭学波、康超、周艳君、董晓辉、 田峰。 II DB42/T 790—2012 引 言 甲型 H1N1 流感病毒已对人类公共卫生安全造成重大威胁，并在猪群等哺乳动物之中广泛传播，给 人类和畜牧业带来重大灾难。为鉴别诊断甲型 H1N1 流感病毒(北美流感)和经典 H1N1 流感病毒，特制 定《甲型 H1N1 流感病毒双抗体 ELISA 检测方法》，本方法可以区分甲型 H1N1 流感病毒(北美流感) 和经典 H1N1 流感病毒。 III DB42/T 790—2012 甲型 H1N1 流感病毒双抗体 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了甲型 H1N1 流感病毒的双抗体 ELISA 检测方法的缩略词、实验原理、实验条件、实 验材料、样品处理、实验方法、结果判定和注意事项等。 本标准适用于检测猪的鼻拭子、内脏组织、鸡胚尿囊液、细胞培养物中的甲型 H1N1 流感病毒。 2 缩略词 下列缩略词适用于本文件。 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）：酶联免疫吸附试验 OD630nm 值：630 纳米波长处的吸光值 HRP：辣根过氧化物酶 S：样品测定孔 OD630nm 值 3 实验原理 本方法用抗甲型 H1N1 流感病毒的单克隆抗体包被固相载体酶标板。加入待检样品后，如果待检物 中含有甲型 H1N1 流感病毒即可发生抗原抗体反应，洗板后，加入 HRP 标记的抗甲型 H1N1 流感病毒 的单克隆抗体，能继续反应形成抗原抗体复合物，在遇到相应的底物时，复合物中的酶能催化底物反应 发生显色。其显色的深浅与相应的抗体量成正比，可借助 OD630nm 值的大小进行定性判断。 4 实验条件 4.1 实验室 实验操作宜在常温（18 ℃～25 ℃）进行。 4.2 仪器 台式低温高速离心机、微量移液器、冰箱、恒温箱、酶标检测仪。 4.3 人员 注意个人防护和环境保护。 5 实验材料 5.1 5.2 5.3 抗甲型 H1N1 流感病毒的单克隆抗体。 酶标板： 96 孔板，可拆。 酶结合物： HRP 标记的抗甲型 H1N1 流感病毒的单克隆抗体。 1 DB42/T 790—2012 5.4 阳性对照：含甲型 H1N1 流感病毒的鸡胚尿囊液灭活处理。 5.5 阴性对照：未接种甲型 H1N1 流感病毒的鸡胚尿囊液。 5.6 其他试剂：包被液、封闭液、洗涤液、样品处理液 A、样品处理液 B、底物液 A、底物液 B、终 止液（见附录 A） 6 样品处理 6.1 鼻拭子 用无菌棉拭子于猪鼻腔中沾取渗出液，然后浸泡于 1 mL 样品处理液 B 中，涡旋仪震荡 1 min 后挤 出棉拭子中的液体，冻融 3 次后于 37 ℃孵育 15 min，12,000 r/min 离心 5 min，取上清。 6.2 内脏组织 剪取组织块约 1 g，置于匀浆器中，加入 1 mL 样品处理液 A 后匀浆，冻融 3 次后，置于 37 ℃下 15 min，10,000 r/min 离心 5 min，取上清。 6.3 鸡胚尿囊液 用样品处理液 B 等体积稀释后，置于 37 ℃下 15 min，每隔 3 min～5 min 混匀 1 次，10,000 r/min 离心 30 sec～60 sec，取上清。 6.4 细胞培养物 细胞培养物可直接用于检测或者冻融一次后检测。 7 实验方法 7.1 抗甲型 H1N1 流感病毒的单克隆抗体用包被液稀释到工作浓度（2 μg/mL），加入酶标板，100 μL/ 孔，37 ℃孵育 2 h。加入封闭液，200 μL/孔，于 37 ℃封闭 2 h，取出酶标板在吸水纸上拍干，于 2 ℃～ 8 ℃保存备用。 7.2 先用洗涤液 200 μL/孔洗板 1 次，加入处理好的样品，100 μL/孔；同时设阳性对照和阴性对照各 1 孔，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。 7.3 弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗板 3 次，200 μL/孔。每次静置 3 min 后倒掉液体， 在吸水纸上拍干。 7.4 加入酶结合物，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。 7.5 重复 7.3 步骤。 7.6 每孔加底物液 A 和底物液 B 各一滴（约 50 μL），混匀，置室温下（18 ℃～25 ℃）避光显色 10 min。 7.7 每孔加终止液一滴（约 50 μL），混匀。 7.8 用酶标仪测定各孔的 OD630nm 值，应在加入终止液后 10 min 内完成。 8 结果判定 8.1 8.2 2 ELISA 试验成立的条件为：阳性对照孔 OD630nm 值≥0.8；阴性对照孔 OD630nm 值＜0.2。 如果 S≥0.25，判为阳性；如果 S＜0.25，判为阴性。 DB42/T 790—2012 9 注意事项 实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。 3 DB42/T 790—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配置 A.1 包被液 碳酸钠（Na2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93 g 加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL 即可，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.2 封闭液 5 g 脱脂乳溶于 100 mL 洗涤液。置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.3 洗涤液 氯化钠（NaCl） 8g 氯化钾（KCl ） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 2.9 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g Tween-20 0.5 mL 加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL 即可，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.4 样品处理液A 四硼酸钠（Na2B4O7 •10H2O） 13.3 g 硼酸（H3BO3） 16.08 g 氯化钠（NaCl） 8.5 g 加蒸馏水或去离子水 800 mL，调 pH 值至 8.4 后定容至 1000 mL，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.5 样品处理液B N-乙酰-L-半胱氨酸 5g NP-40 5 mL 加 1000 mL 经 121 ℃高压蒸汽灭菌 30 min 的样品处理液 A，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.6 底物液A 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 柠檬酸 过氧化氢脲 4 14.6 g 9.33 g 0.52 g DB42/T 790—2012 加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL，调至 pH 值至 5.0～5.4，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 A.7 底物液B 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 14.2 g 柠檬酸 10.5 g 联苯二胺 (TMB) 10 g 加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL，调 pH 值至 5.0，置 2 ℃～8 ℃避光保存备用。 A.8 终止液 氢氟酸（HF）6.25 mL，加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL，置 2 ℃～8 ℃保存备用。 _________________________________ 5