鹅星状病毒感染诊断技术规范

ICS 11.220 CCS B 41 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4459—2021 鹅星状病毒感染诊断技术规范 Diagnostic technicalspecification for goose astrovirus infection 2021-12-27 发布 2022-01-27 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 4459—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 I DB37/T 4459—2021 鹅星状病毒感染诊断技术规范 1 范围 本文件规定了鹅星状病毒感染的临床诊断和实验室诊断的技术规范。其中临床诊断包括流行病学、 临床症状、病理变化；实验室诊断包括样品的采集与保存、病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。 本文件适用于鹅星状病毒感染的诊断、检测、监测和流行病学调查。鹅星状病毒感染的流行病学、 临床症状、病理变化适用于鹅星状病毒的初步诊断；病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法 适用于鹅组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鹅星状病毒分离鉴定及核酸检测；间接ELISA抗体检测 方法适用于鹅星状病毒感染的抗体特异性血清学诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489—2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鹅星状病毒感染 goose astrovirus infection 由鹅星状病毒引起的5日龄～25日龄雏鹅内脏器官与关节发生严重尿酸盐沉积的疾病。 4 实验室要求 4.1 环境 4.1.1 实验室符合 GB 19489—2008 和 GB/T 27401 要求。 4.1.2 从事 RT-PCR 工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、 电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理， 避免对实验室造成污染。 4.1.3 生物样品应严格控制避免对环境造成污染，试验结束后应将相关样品（如血样）进行无害化处 理。 4.2 人员 1 DB37/T 4459—2021 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、血清学和分子生物学实验室检测技术培训。熟 悉临床诊断、病理组织学诊断、生物样品处理、病毒分离，以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术， 熟悉RT-PCR、qRT-PCR与间接ELISA检测结果的判断方法。 5 样品 5.1 仪器设备 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 生物安全柜。 解剖剪。 解剖盘。 镊子。 组织匀浆器。 5.2 试剂与材料 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 磷酸盐缓冲液（PBS），见 A.1。 青霉素（100 000 IU/mL）。 链霉素（100 mg/mL）。 离心管。 样品保存管。 滤器（孔径 0.22 μm）。 5.3 样品采集与运送 5.3.1 总则：样品采集、保存、运输应按照 NY/T 541—2016 技术规范进行。采样和样品前处理过程中 应戴一次性手套、口罩、帽子，采样过程中样品不得交叉污染。 5.3.2 组织样品：采集疑似鹅星状病毒感染死亡鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品。采集病料时，用 无菌手术剪取组织样品，置于样品保存管中，密封、编号。 5.3.3 泄殖腔/喉拭子样品：活禽泄殖腔/喉拭子样品，置于样品保存管中。 5.3.4 血清样品：用无菌注射器采血 1 mL，将其注入 1.5 mL 无菌 eppendorf 管中，于 37 ℃静置 2 h。 分离的血清转入新的无菌 eppendorf 管中，加盖，编号，待检。采集的血清样品应无溶血，置于离心管 中。 5.3.5 鹅胚尿囊液：将鹅胚尿囊液加入无菌 eppendorf 离心管中，加盖，编号，待检。 5.3.6 所有样品应置于密闭容器中冷藏运输，保存温度在-15 ℃以下，时间不超过 24 h。 5.4 样品处理与保存 5.4.1 样品应在生物安全柜中进行处理，取 10 g～20 g 样品放入灭菌的研钵中磨碎。研磨充分的组织 置于含青霉素（2 000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制霉菌素（1 000 IU/mL） 的 pH 值 7.0～7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，A.1）中，配制成 10 %～20 %（g/mL）的悬液。样品经 10 000 r/min 离心 30 min，取上清液经 0.22 μm 滤器过滤除菌后，作为接种和检测材料。 5.4.2 泄殖腔/咽喉拭子置于含青霉素（2 000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL） 和制霉菌素（1 000 IU/mL）的 pH 值 7.0～7.4 的 PBS 中。样品剧烈震荡后，10 000 r/min 离心 10 min， 取上清作为检测材料。 5.4.3 鹅胚尿囊液在 4 ℃下经 10 000 r/min 离心 10 min，将上清液转入无菌 eppendorf 管中，加盖， 编号，待检。 2 DB37/T 4459—2021 5.4.4 所有样品保存温度在-15 ℃以下，不超过 2 wk；-70 ℃贮存不超过 30 d。 5.5 检测要求 在每次检测过程中，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。 6 临床诊断 6.1 流行病学 鹅群发病日龄集中于5日龄～20日龄，5日龄左右开始发病，死亡率逐渐升高，10日龄～15日龄为死 亡高峰，鹅群的死亡率为20 %～30 %，最高可达50 %。 6.2 临床症状 患病雏鹅表现为精神沉郁、卧地倦动、采食减少、排白色稀便。 6.3 剖检变化与组织学变化 死亡雏鹅剖检变化主要表现为内脏器官和关节腔有大量尿酸盐沉积，包括心脏、肝脏、肾脏及输尿 管等，有的病例表现为肾脏出血肿大。患鹅组织学变化主要表现为肾小管上皮细胞坏死、间质出血，肾 小球肿胀，脾脏有大量红细胞浸润，肝细胞空泡变性、尿酸盐沉积。 6.4 临床诊断结果判定 同时符合6.1、6.2、6.3，则判断为疑似鹅星状病毒感染。 7 病毒分离鉴定 7.1 病毒分离 7.1.1 仪器设备与材料 7.1.1.1 7.1.1.2 7.1.1.3 7.1.1.4 7.1.1.5 7.1.1.6 7.1.1.7 7.1.1.8 不同温度的冰箱（2 ℃～8 ℃、-20 ℃、-70 ℃）。 37 ℃恒温孵化箱。 4 ℃离心机。 打孔器。 1 mL 注射器。 石蜡。 照蛋器。 13 日龄鹅星状病毒血清抗体阴性鹅胚。 7.1.2 样品接种和培养 7.1.2.1 将处理后的样品上清，经绒毛尿囊腔途径无菌接种 13 日龄鹅胚，0.2 毫升/枚，37 ℃孵育， 连续观察 6 d。 7.1.2.2 弃去 24 h 内死亡鹅胚，24 h～144 h 内死亡和存活鹅胚置于 4 ℃冰箱过夜或-20 ℃冷冻 1 h， 分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。 7.1.3 病毒分离结果判定 3 DB37/T 4459—2021 组织样品处理液接种鹅胚后，当胚体3 d～5 d内出现死亡，且胚体尿囊膜增厚，死亡鹅胚全身皮肤 及胚体腹膜有点状出血斑，肝脏、肾脏、肺脏均呈现点状出血等变化，可判断为鹅疑似星状病毒感染。 7.2 病原检测 7.2.1 RT-PCR 反应 7.2.1.1 仪器设备 7.2.1.1.1 7.2.1.1.2 7.2.1.1.3 7.2.1.1.4 7.2.1.1.5 7.2.1.1.6 7.2.1.1.7 7.2.1.1.8 7.2.1.1.9 7.2.1.1.10 7.2.1.1.11 7.2.1.1.12 生物安全柜。 PCR 基因扩增仪。 台式低温高速离心机（最大转速为 15 000 r/min）。 无 RNA 酶离心管（1.5 mL）。 PCR 反应管（0.2 mL）。 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL）。 无 RNA 酶带滤芯枪头。 核酸电泳仪。 核酸电泳槽。 紫外凝胶成像仪。 电子天平：精度为 0.01 g。 电磁炉或微波炉。 7.2.1.2 试剂与材料 7.2.1.2.1 DEPC 水。 7.2.1.2.2 商品化 RNA 提取试剂盒。 7.2.1.2.3 RT 反应试剂盒。 7.2.1.2.4 PCR 反应试剂。 7.2.1.2.5 1.0 %琼脂糖凝胶，见 A.2。 7.2.1.2.6 1×TAE 缓冲液，见 A.3。 7.2.1.2.7 核酸染料。 7.2.1.2.8 核酸电泳加样缓冲液，见 A.4。 7.2.1.2.9 DNA 分子量标准，要求在 100 bp～2 000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带。 7.2.1.2.10 阳性对照标准品，使用鹅星状病毒 SDPY 株（CCTCC NO: V201808，见附录 C），或其他背 景清楚的鹅星状病毒。 7.2.1.2.11 阴性对照标准品，为健康鹅正常组织或未感染鹅星状病毒鹅胚尿囊液。 7.2.1.2.12 RT-PCR 检测所需引物： ——上游引物 F：5’- TGGTGGTGYTTYCTCAARA -3’； ——下游引物 R：5’-GYCKGTCATCMCCRTARCA-3’，扩增片段长度为 601 bp，引物浓度为 10 μmol/L。 7.2.1.3 试验程序 7.2.1.3.1 RNA 提取 按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70 ℃冻存。 7.2.1.3.2 RT-PCR 反应 7.2.1.3.2.1 反转录体系及程序 4 DB37/T 4459—2021 RNase Inhibitor 0.5 μL，M-MLV buffer 2 μL，Random Primers 1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 1 μL，RNase M-MLV 0.5 μL，RNA模板5 μL，共计10 μL。反转录反应程序为30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min， 70 ℃ 15 min，4 ℃终止。 7.2.1.3.2.2 PCR 反应体系及程序 在试剂准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样，反应体系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物F（10 μmol/L）和R（10 μmol/L）各0.5 μL，模板cDNA 3 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，加DEPC水至25 μL。 瞬时离心，置于PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。 7.2.1.3.2.3 琼脂糖凝胶电泳 1.0 %琼脂糖凝胶板的制备：称取1 g琼脂糖，加入100 mL 1×TAE缓冲液中。加热融化后加5 μL核酸 染料溶液，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。 待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。 加样：取6 μL～8 μL PCR扩增产物和2 μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设标 准DNA Marker、阴性对照、阳性对照。 电泳：电压80 V～100 V或电流40 mA～50 mA，电泳30 min～40 min。最后，由凝胶成像系统观察并拍 照记录。 7.2.1.4 结果判定 7.2.1.4.1 试验成立的条件 阳性对照出现601 bp的扩增条带，且阴性对照无扩增条带时，判定试验结果成立。 7.2.1.4.2 试验结果的判定 7.2.1.4.2.1 在试验成立的前提下，待检样品出现 601 bp 的条带，判定待检样品为鹅星状病毒 PCR 阳 性，必要时，对扩增片段进行序列测定。 7.2.1.4.2.2 在试验成立的前提下，待检样品无条带，则为鹅星状病毒 PCR 阴性（见 B.1）。 7.2.2 实时荧光定量 RT-PCR 7.2.2.1 仪器设备 7.2.2.1.1 7.2.2.1.2 7.2.2.1.3 7.2.2.1.4 7.2.2.1.5 7.2.2.1.6 7.2.2.1.7 生物安全柜。 台式低温高速离心机（最大转速为 15 000 r/min）。 无 RNA 酶的离心管（1.5 mL）。 无 RNA 酶的荧光定量 PCR 管。 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL）。 无 RNA 酶带滤芯的枪头。 荧光定量 PCR 仪。 7.2.2.2 试剂与材料 7.2.2.2.1 DEPC 水。 7.2.2.2.2 商品化 RNA 提取试剂盒。 5 DB37/T 4459—2021 7.2.2.2.3 一步法荧光定量 RT-PCR 试剂盒。 7.2.2.2.4 阳性对照标准品，使用鹅星状病毒 SDPY 株（CCTCCNO：V201808），或其他背景清楚的鹅星 状病毒。 7.2.2.2.5 阴性对照标准品，为健康鹅正常组织或未感染鹅星状病毒鹅胚尿囊液。 7.2.2.2.6 荧光定量 RT-PCR 检测所需引物及探针： ——上游引物 F：5’- GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3’； ——下游引物 R：5’- GACCTATTTCCTTGCGGATCAC -3’； ——探针 P：5’FAM-TCGGCTCAACATCGCTGATGGG-BHQ3’，扩增片段长度为 89 bp，引物浓度为 10 μ mol/L。 7.2.2.3 试验程序 7.2.2.3.1 RNA 提取 RNA提取参照7.2.1.3.1。 7.2.2.3.2 实时荧光定量 RT-PCR 反应体系及程序 在实验室洁净区域，将试剂盒中预混液、引物和探针取出，置于冰上融化，将下列试剂一次加入到 无RNA酶的荧光定量PCR管中。反应体系如下：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，Takara Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixII 0.4 μL，引物F（10 μmol/L）和引物R（10 μmol/L）各 0.4 μL，探针P（10 μmol/L）0.8 μL，模板RNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。反应液混匀后置于 LightCycler®96荧光定量PCR仪按照以下程序进行扩增：42 ℃反转录5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃变性5 s， 60 ℃ 退火20 s（收集信号），进行40个循环。 7.2.2.4 结果判定 7.2.2.4.1 试验成立的条件 阳性对照出现S型扩增曲线，且阴性对照无扩增曲线时，判定检测结果有效。 7.2.2.4.2 试验结果的判定 7.2.2.4.2.1 Ct 值≤30，且出现 S 型扩增曲线，表明样品中存在鹅星状病毒，判定为阳性。 7.2.2.4.2.2 无 Ct 值，且无扩增曲线，或 Ct 值＞35，表明样品中无鹅星状病毒，判定为阴性。 7.2.2.4.2.3 30＜Ct 值＜35 的样品，判定为可疑，需重新检测（见 B.2）。 8 病毒抗体检测（间接 ELISA） 8.1 仪器设备 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.1.6 台式高速离心机（最大转速为 15 000 rpm）。 酶标仪。 微量移液器：最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 聚苯乙烯板。 水平振荡器。 37 ℃培养箱。 8.2 试剂与材料 6 DB37/T 4459—2021 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.2.6 8.2.7 8.2.8 8.2.9 标准阳性血清，见 D.1。 标准阴性血清，见 D.2。 鹅星状病毒抗原，见 D.3。 酶标二抗：兔抗鹅辣根过氧化物酶标记的 IgG，效价应在 1:32 以上。 包被液，见 A.5。 洗涤液，见 A.6。 样品稀释液（封闭液），见 A.7。 底物溶液，TMB 底物显色液。 终止液（浓度为 2 M），见 A.8。 8.3 操作步骤 8.3.1 将 ORF2 蛋白抗原按照浓度为 6.5 mg/mL 用 1×碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释 2 000 倍，每孔 100 μ L 加入到 96 孔聚苯乙烯板中，4 ℃孵育过夜。孵育后洗涤液洗 5 次，甩干板上残余液体。 8.3.2 用样品稀释液将被检血清样品稀释 40 倍，注意不要稀释对照血清。确保每个样品换一个吸头， 做好样品的标记。稀释的样品血清充分混匀后，加入包被孔。 8.3.3 每孔加入 200 μL 封闭液，37 ℃温箱孵育 1 h，用 8.3.1 方法洗板。 8.3.4 在 A1、A2 孔各加 100 μL 阴性血清对照，A3、A4 孔各加 100 μL 阳性血清对照。 8.3.5 将 100 μL 稀释好的待检血清加入其他各孔，混匀后，37 ℃孵育 1 h，用 8.3.1 方法洗板。 8.3.6 酶标二抗用样品稀释液按 1:200 倍稀释，每孔加入 100 μL，37 ℃孵育 1 h，用 8.3.1 方法洗板。 8.3.7 每孔加入 100 μL TMB 显色液，37 ℃避光条件下孵育 15 min。 8.3.8 每孔加入 50 μL 终止液，轻轻振荡，终止反应。 8.3.9 将酶标板置于酶标仪中，于 450 nm 测定各孔样品的吸光值（OD）。 8.4 结果判定 8.4.1 试验成立的条件 鹅星状病毒间接ELISA检测方法阴性对照OD均值=（ODA1 +ODA2）/2；阳性对照OD均值=（ODA3 + ODA4） /2；阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.04；阴性对照平均值必须小于等于0.17，试 验条件成立，否则重复测定。 8.4.2 试验结果的判定 8.4.2.1 当样品 OD450≥0.21 时，样品判定为鹅星状病毒抗体阳性。 8.4.2.2 当样品 OD450≤0.17，样品判定为鹅星状病毒抗体阴性。 8.4.2.3 当样品 0.17＜OD450＜0.21，判为可疑，需重复测定。 9 鹅星状病毒感染综合判定 根据第6章、第7章、第8章中的判定结果，可对鹅星状病毒感染进行综合判定。 9.1 若患鹅与第 6 章中所描述相符，且第 7 章、第 8 章中结果均呈阳性，则可判定为鹅星状病毒感染。 9.2 若患鹅与第 6 章中所描述部分相符，但第 7 章、第 8 章中结果均呈阳性，则可判定为鹅星状病毒 感染。 9.3 若患鹅在第 7 章中的结果呈阳性，但在第 8 章中的结果呈阴性，也可判定为鹅星状病毒感染。反 之则不成立。 7 DB37/T 4459—2021 A A 附 录 A （资料性） 相关试剂的配制（试剂要求分析纯） A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L pH 7.4） NaCl KCl KH2PO4 Na2HPO4.12H2O 水加至 8.0 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 1 000 mL A.2 1.0 %琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0 g 0.5×TAE电泳缓冲液加至 100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 ℃～60 ℃时加入核酸染料，摇匀。倒入板上凝固后，取下梳子，备 用。 A.3 1×TAE 电泳缓冲液的配制 A.3.1 配制0.5 mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0） 乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2.2H2O） 18.61 g 灭菌双蒸水 80.0 mL 氢氧化钠调pH至 8.0 水加至 100 mL 用于配制A.3.2中的50×TAE电泳缓冲液。 A.3.2 配制50×TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 冰醋酸 0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0） 灭菌超纯水加至 用于配制A.3.3中的1×TAE电泳缓冲液。 242 g 57.1 mL 100 mL 1 000 mL A.3.3 配制1×TAE电泳缓冲液 50×TAE电泳缓冲液 水加至 20 mL 1 000 mL A.4 核酸电泳加样缓冲液（10×） 聚蔗糖 灭菌双蒸水 溴酚蓝 二甲苯青 25 g 100 mL 0.1 g 0.1 g A.5 包被液（0.05 mol/L pH 9.6） 8 DB37/T 4459—2021 Na2CO3 NaHCO3 水加至 0.275 6 g 0.621 6 g 100 mL A.6 洗涤液 PBS Tween-20 1 000 mL 0.5 mL A.7 样品稀释液（封闭液） 脱脂奶粉 洗涤液 5.0 g 100 mL A.8 终止液（2 M） H2SO4（98 %） 水 58 mL 442 mL 9 DB37/T 4459—2021 B B 附 录 B （资料性） PCR 及荧光定量 PCR 结果图 B.1 PCR 产物大小对照 M为分子量标准；1为阴性对照，2为阳性对照。 图B.1 PCR 产物大小对照图 B.2 荧光定量 PCR 扩增曲线 1为阳性对照，2为阴性对照。 图B.2 荧光定量 PCR 扩增曲线 10 DB37/T 4459—2021 C C 附 录 C （资料性） 阳性对照病毒（SDPY） C.1 SDPY 鹅星状病毒的来源 SDPY鹅星状病毒，是一种鹅源病毒，由山东农业大学禽病学实验室分离并鉴定，保藏于中国典型培 养物保藏中心（CCTCC），其保藏编号为CCTCC NO: V201808。该病毒可由山东农业大学禽病学实验室提 5.0 供，由13日龄血清抗体阴性鹅胚接种病毒后，收集死亡胚体尿囊液后离心所得，病毒滴度≥10 ELD50。 C.2 SDPY 鹅星状病毒涉及的专利信息 该病毒株涉及以下专利： 一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法。专利号：ZL 2018 1 0494586.X，专利公布日： 2020.06.12。专利申请人：山东农业大学。 11 DB37/T 4459—2021 D D 附 录 D （资料性） ELISA 抗原和血清标准 D.1 鹅星状病毒阳性血清制备 用鹅星状病毒SDPY株感染3周龄～4周龄健康雏鹅，感染后2周采血，分离血清，-15 ℃以下保存。 用于鹅星状病毒ELISA抗体检测。 【性状】-15 ℃以下，淡黄色固体，室温下可融化。 【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无菌生长。 【效价测定】用中和试验测定，对100 ELD50鹅星状病毒SDPY株的中和效价不低于5。 D.2 鹅星状病毒阴性血清制备 健康雏鹅在隔离器中饲养至3～4周龄，采血，分离血清，-15 ℃以下保存。用于鹅星状病毒ELISA 抗体检测。 【性状】-15 ℃以下，淡黄色固体，室温下可融化。 【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无菌生长。 【效价测定】用中和试验测定，对100 ELD50鹅星状病毒SDPY株的中和效价不高于1:2。 D.3 鹅星状病毒抗原制备 D.3.1 目的基因扩增及原核表达载体构建 根据SDPY株ORF2基因序列设计一对特异性引物，序列如下： ORF2-F：5’-CCATGGCTGATATCGGATCCATGCCACAGGCAGAATCCAG-3’； ORF2-R：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGTCGACTCATGTCCGCCCTT-3’，扩增片段长度为759 bp，引物 浓度为10 μmol/L。（下划线分别为BamH Ⅰ与Sal Ⅰ酶切位点） 对SDPY株的ORF2基因序列进行扩增后，纯化回收该片段，同时对原核表达载体PET-32a进行双酶切， 构建ORF2-PET 32a重组表达载体。 D.3.2 ORF2重组蛋白表达及纯化 在0.1 mmol/L IPTG浓度下诱导4 h，进行蛋白表达。经SDS-PAGE电泳后，蛋白以包涵体形式表达， 大小为44 KD。同时利用镍柱进行蛋白纯化，纯化后的蛋白浓度6.5 mg/mL，以此作为本文件间接ELISA 方法的包被抗原。 12