青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞增殖_凋亡及Caspase_3活性的影响.pdf

Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 33 卷第 3 期 2010 年 3 月 ·407· 青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞增殖 、 凋亡及 Caspase23 活性的影响 1 2 3 1 1 1 1 吴喜利 ,张王刚 ,石兴民 ,安 鹏 ,孙万森 ,乔成林 ,王 竹 ( 11 西安交通大学医学院第二附属医院中西医结合科 /陕西省中医重点专科 /肾病科 ,陕西 西安 710004; 21 西安交通大学医学院第二附属医院血液科 ,陕西 西安 710004; 31西安交通大学医学院 ,陕西 西安 710061 ) 目的 : 观察青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞 ( mesangial cell, MC ) 增殖 、 凋亡及 Caspase 23 活性的影响 。方 摘要 法 :以体外培养大鼠肾小球系膜细胞为研究对象 ,应用不同质量浓度青蒿素干预系膜细胞 ,分别采用甲基噻唑基四 唑 (methyl thiazolyl tetrazolium ,M TT)比色法 、 荧光倒置显微镜及酶标分析仪检测系膜细胞的增殖 、 凋亡及 Caspase 23 活性 。结果 : 与对照组比较 ,不同质量浓度青蒿素对肾小球系膜细胞的增殖及 Caspase 23 活性均有不同程度的影响 ( P < 0101 ) ; 与地塞米松组比较 ,其他 2 组相同质量浓度药物对肾小球系膜细胞增殖及 Caspase 23 活性均有显著影 响 ( P < 0101 ) ,尤以青蒿素联合地塞米松高剂量组的抑制作用最强 ,且 3 组药物对肾小球系膜细胞的增殖 、Caspase 2 3 活性及其凋亡的影响均呈剂量依赖趋势 ,在中 、 高剂量药物联合治疗组中出现了系膜细胞大量死亡 。结论 : 青蒿 素能剂量依赖性抑制系膜细胞增殖 、 增强 Caspase 23 活性及促进肾小球系膜细胞凋亡 。 关键词 青蒿素 ; 系膜细胞 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ; Caspase23 活性 中图分类号 : R28515 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 24454 ( 2010 ) 03 20407 204 Effects of Artem isin in on Prolifera tion, Apoptosis and Ca spa se 23 Expression of Ra t M esang ia l Cell WU Xi2li , ZHANG W ang2gang , SH I Xing2m in , AN Peng , SUN W an 2sen , Q IAO Cheng2lin ,WANG Zhu 1 2 3 1 1 1 1 ( 11 Departm ent of integrated Chinese Traditional and W estern M edicine, Shanxi Province Key TCM Departm ent of Nephrology, Second Affiliated Hosp ital, M edical School of Xi′ an J iaotong University, Xi′ an 710004, China; 21 Departm ent of Hematology, Second Affilia2 ted Hosp ital,M edical School of Xi′ an J iaotong University, Xi′ an 710004, China; 31 M edical School of Xi′ an J iaotong University, Xi′ an 710061, China ) Abstract Objective: To study the effects of artem isinin on p roliferation, apop tosis and Caspase 23 active of rat mesangial cell1 M ethods: Rat mesangial cells were incubated with different concentrations of artem isinin, the p roliferation, apop tosis and Caspase23 ac2 tive of rat mesangial cell were measured by M TT assay, fluorescent inverted m icroscope and enzyme 2labeled analytical instruments re2 spectively1 Results: Compared with control group, the p roliferation and Caspase23 exp ression of mesangial cell of three other group s were sinificantly different ( P < 0101 ) 1 Compared w ith dexamethasone group, there were significant difference effects of p roliferation and Caspase 23 exp ression of mesangial cell in other two group s of identical concentration drugs ( P < 0101 ) , especially in the artem isinin + glucocorticoid (A rtGC ) group, and the effects of three different drugs on the mesangial cell Caspase23 exp ression, p roliferation and ap 2 op tosis had the tendency of depend on dosage, and mass mortality of mesangial cell in the mediate 2dosage and high 2dosage A rtGC group 1 Conclusion: A rtem isinin could inhibit the p roliferation of mesangial cell, enhance the exp ression of Caspase 23 and p romote the apop tosis in a dose 2dependent manner1 Key words A rtem isinin; M esangial cell; Proliferation; Apop tosis; Caspase 23 系膜细胞 (mesangial cell, MC ) 位于肾小球毛细 血管小叶的中心部位 ,具有多种功能 ,如分泌细胞外 基质 ( extracellular matrix, ECM ) 、 产生细胞因子 、 并 具有吞噬清除大分子物质以及类似平滑肌细胞的收 缩功能 ,是肾小球中最活跃的固有细胞成分 。在正 常情况下 , MC 不发生明显的增殖活动 ,而在炎症等 病理情况下 , 则可见异常增殖 。MC 过度增殖一方 面突入肾小球毛细血管腔导致管腔狭窄或闭塞 ; 另 一方面又可使 ECM 大量产生和积聚 ,这是多种肾脏 疾病包括狼疮性肾炎 ( LN ) 特别是 Ⅳ型 LN 的核心 〔1 〕 病理环节 ,是促使肾小球硬化的主要因素 。故探 索抑制系膜细胞增殖 、 并诱导其凋亡的药物 ,对延缓 慢性肾小球疾病的发生 、 发展具有重要的临床意义 。 青蒿素 ( artem isinin, A rt)是从菊科植物黄花蒿 ( A rte2 收稿日期 : 2009 208 204 基金项目 : 陕西省科技计划项目 [ 2006K14 202 ( 5 ) ] 作者简介 : 吴喜利 ( 1975 2) , 男 , 主治医师 , 博士 , 主要从事中西医结合防 治慢性 肾脏疾病研究 ; Tel: 13720618016, E 2mail: wuxili1984 @ 1631 com。 ·408· Journal of Chinese M edicinal M aterials m isia annua L 1 )和青蒿 (A 1 apiacea Hance ) 叶中提取 分离出的主要药用成分 , 有研究表明菁蒿素除具有 抗疟疾作用以外还具有免疫调节 、 抑制细胞增殖及 〔2 26 〕 诱导细胞凋亡 等多种药理作用 ,但对肾脏疾病的 治疗作用尚不明了 。本实验以肾小球系膜细胞为研 究对象 ,观察青蒿素对肾小球系膜细胞增殖 、 凋亡及 Caspase 23 活性的影响 。 1 材料与仪器 1 1 1 细胞株 大鼠肾小球系膜细胞株 , 购于武汉 大学国家细胞保存中心 。 1 12 药物与试剂 Caspase 23 检测试剂盒 , 由上海 森雄生物技术公司提供 ; 丫碇橙 ( AO ) 染液 , 由 Sig2 m a公司提供 ; 胰蛋白酶 , 由 Gibco 公司提供 ; 胎牛血 清 ( fetal calf serum , FCS) ,由天津灏洋生物技术公司 提供 ; 甲基噻唑基四唑 ( methyl thiazolyl tetrazolium , M TT) ,由 Am resco 公司提供 ; 地塞米松 ,由西安天丰 生物科技有限公司提供 ; 青蒿素 ,由西安利君制药有 限责任公司提供 。 1 1 3 主要仪器 相差倒置显微镜 ( ECL IPSE TE 300 型 , 日 本 N ikon 公 司 ) ; B16 型 CO2 培 养 箱 ( Heraeus 公司 ) ; B iotrak 22 型酶标分析仪 ( Amersham 公司 ) ; 荧光倒置显微镜 ( Leica 公司 ) ; CX31 光学显 微镜 (日本 N ikon 公司 ) 。 第 33 卷第 3 期 2010 年 3 月 浓度 ) 、200100 (高浓度 )μmol/L 的青蒿素 ( B 组 ) 及 0 (对 照 ) 、( 25100 + 25100 ) (低 浓 度 ) 、( 50100 + 50100 ) (中 浓 度 ) 、( 100100 + 100100 ) (高 浓 度 ) μmol/L 的青蒿素和地塞米松 ( C 组 ) , 各 组 每 个 剂 量均为 6 复孔 , 各孔用脂多糖 ( 10 μg /mL ) 刺激增 生。 2 1 3 M TT法测定系膜细胞的增殖 培养 24 h 后 收集上清备用 , 然后每孔加 90 μL RPM I21640 不完 全培养液 ,再各加 10 μL M TT ( 5 g /L ) , 调零孔不加 M TT而以 10 μL RPM I21640 不完全培养液代之 , 放 回培养箱继续培养 4 h,弃上清 ,各加 100 μL 二甲亚 砜震荡后 , 在 570 nm 波长下采用 B iotrak 22 型酶标 分析仪检测各孔光密度 D (λ)值 。 2 1 4 系膜细胞 Caspase 23 活性表达检测 将细胞 悬液接种于 6 孔板 ,经上述处理 24 h 后用胰酶消化 离心收集细胞 ,冷 PBS液洗涤 1 ～2 次 , 按照试剂盒 说明书 ,用酶标仪定量检测 Caspase 23 活性 。 2 1 5 系膜细胞凋亡的检测 经上述处理后 , 各组 立即吸出 90 μL 细胞悬液 ,滴加于载玻片上 ,加入丫 碇橙 ( AO ) 染液 5 μL , 混匀后压上盖玻片 。荧光倒 置显微镜 (滤光片 515 nm )下观察凋亡细胞形态 ,于 20 m in 内计数 500 个细胞并拍照 。 从液氮中取 统计学处理 所有实验数据均以 xg ±s表示 , 用 SPSS 1510 软件包进行 t检验 , P < 0105 为有显著 性差异 。 出冻存的大鼠肾小球系膜细胞 ,迅速放入 37 ℃水浴 中不断摇动冻存管 , 使冻存液在 1 m in 之内完全融 化 ,吸取冻存液放入离心管中 ,加入 9 mL 培养液混 匀 , 1 000 r/m in 离心 5 m in 洗涤去除 DM SO。加 1 mL 培养液悬浮 , 1 ∶ 2 接种于 25 mL 培养瓶中 , 每瓶 结果 3 1 1 青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 对照组 MC 体积稍增大 , 数量较多 , 两端略突起 , 向 梭型方向发展 , 核居中央 , 表面微绒毛变短 , 变粗 ; 其他不同药物剂量组 MC 数量明显减少 , 体积变 中加培养液 4 mL , 吹打混匀 , 置于 5% CO2 孵箱中 37 ℃培养 ,至细胞生长至瓶底 80% ～100%左右 ,弃 培养液 ,加 D 2Hanks液洗 1 遍 , 0125%胰酶 2 mL ,置 37 ℃消化 5 m in, 待细胞回缩变圆 , 弃消化液 , 加 2 mL 培养液吹打瓶壁使细胞脱落 , 分散成单细胞悬 小 , 向多呈圆形或椭圆形 , 胞体可有树枝状突起 , 核周胞质散布大量的细小颗粒 。与对照组比较 , 不同浓度青 蒿 素 对 肾 小 球 系 膜 细 胞 增 殖 均 有 显 著的抑 制 作 用 ( P < 0 1 01 ) ; 与 地 塞 米 松 组 比 较 , 其他 2 组相 同 浓 度 药 物 对 肾 小 球 系 膜 细 胞 增 殖 均有显著的抑制作用 ( P < 0 1 01 ) , 尤以青蒿素 + 方法 2 1 1 肾小球系膜细胞的复苏与培养 2 液 ,分别接种于 2 个新培养瓶 ,置 37 ℃、5% CO2 培 养瓶中培养 。细胞传代培养至第 5 代细胞用于实 验。 2 1 2 实验分组及给药 取第 5 代 MC,用 20% FCS 5 RPM I21640 培养液 , 以 1 ×10 /mL 转种于 96 孔板 内 , 200 μL /孔 ,培养 24 h 后 , 015% FCS RPM I21640 培养液 200 μL /孔培养 24 h, 使细胞同步于 G0 期 后 。每孔 分 别 加 入 0 (对 照 ) 、50100 (低 浓 度 ) 、 100100 (中浓度 ) 、200100 (高浓度 )μmol/L 的地塞 米松 (A 组 ) ; 0 (对照 ) 、50100 (低浓度 ) 、100100 (中 2 16 3 地塞米松高剂量组的抑制作用最强 , 且 3 组药物 对肾小球系 膜 细 胞 的 抑 制 作 用 均 呈 剂 量 依 赖 趋 势 (表 1 , 图 1 ) 。 3 1 2 青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞 Caspase 23 活 性的影响 与对照组比较 , 不同浓度青蒿素对肾小 球系膜细胞 Caspase 23 活性均有显著的增强作用 ( P < 0101 ) ; 与地塞米松组比较 , 其他 2 组相同浓 度 药物对肾小球系膜细胞 Casp a se 23 活性均有显著 影响 ( P < 0 101 ) ,尤以青蒿素 +地塞米松高剂量对 Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 33 卷第 3 期 2010 年 3 月 ·409· 图 1 青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 ( ×200 ) 表 1 青蒿素对大鼠肾小球系膜 表 2 青蒿素对大鼠肾小球系膜细胞 细胞增殖的影响 ( xg ±s, n = 6 ) 组别 Ca spa se 23 活性的影响 ( xg ±s, n = 6 ) 药物浓度 / (μmol/L ) 系膜细胞 增殖 [ D (λ)值 ] 0 01852 ±01004 50 01960 ±01003 33 100 01764 ±01003 33 200 01544 ±01003 33 0 01960 ±01003 ## 50 01864 ±01002 33 ## 100 01756 ±01003 33 200 01623 ±01002 33 ## 0 01964 ±01001 ## 25 + 25 01764 ±01001 33 ## 50 + 50 01533 ±01001 33 ## 100 + 100 01343 ±01001 33 ## 地塞米松组 青蒿素组 青蒿素 +地塞米松组 组别 地塞米松组 注 : 组内与对照比较 , 3 P < 0105, 33 P < 0101; 组间相同浓度与 青蒿素组 青蒿素 +地塞米松组 药物浓度 / (μmol/L ) Caspase 23 活性 [ D (λ) 值 ] 0 01364 ±01001 50 01399 ±01004 100 01463 ±01001 200 01501 ±01002 0 01364 ±01001 50 01423 ±01002 100 01483 ±01001 200 01523 ±01001 0 01364 ±01002 25 + 25 01466 ±01001 50 + 50 01514 ±01002 100 + 100 01573 ±01002 33 33 33 33 ## 33 ## 33 ## 33 ## 33 ## 33 ## 注 : 组内与对照比较 , 3 P < 0105, 33 P < 0101; 组间相同浓度与 地塞米松组比较 , # P < 0105, ## P < 0101 地塞米松组比较 , # P < 0105, ## P < 0101 Caspase 23 活性表达影响最强 , 且 3 组药物对肾小球 3 13 系膜细胞的 Caspase 23 活性表达影响均呈剂量依赖 趋势 (表 2 ) 。 光倒置显微镜下 , 凋亡细胞呈绿色 , 死亡细胞呈红 青蒿素对肾小球系膜细胞凋亡的影响 在荧 色 。对照组系膜细胞凋亡较少 , 各治疗组随着药物 ·410· Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 33 卷第 3 期 2010 年 3 月 浓度的升高 ,凋亡显著增加 , 且呈浓度依赖趋势 ; 地 塞米松 、 青蒿素及青蒿素联合地塞米松对系膜细胞 凋亡的诱导逐渐增强 , 且在中剂量和高剂量药物联 合治疗组中出现了系膜细胞大量死亡 。 4 讨论 胞大量死亡 。关于青蒿素抑制肾小球系膜细胞增殖 及诱导其凋亡的具体作用机制还有待于进一步的研 究。 系膜细胞的增殖及由此所导致的肾小球硬化是 多种肾小球疾病发展的共同途径 , 是各种增殖性肾 病损伤因素作用的靶细胞之一 。在正常情况下 , 肾 小球内系膜细胞数量 、 形态和位置保持相对稳定 ; 系 膜细胞过度增殖以及凋亡减少 , 将引起细胞外基质 [ 1 ] Kamanna VS, Bassa BV , Ganji SH , et a l1 B ioactive lyso2 生成过量和聚积从而导致肾小球系膜区增宽 、 基质 〔7 〕 增生 ,并最终出现肾小球硬化 。 细胞凋亡 ( apop tosis)是多细胞有机体为调控机 体发育 、 维护内环境稳定 、 由一系列凋亡调控基因控 制的细胞主动死亡的过程 , 又称细胞程序性死亡 ( p rogramm ed cell death, PCD ) ,具有特征的形态学改 变和典型的生化特点 。细胞凋亡能清除体内不需要 的或有害的细胞 ,控制细胞数量 ,是维持机体自身稳 定状态的一个重要机制 , 也是免疫系统行使其功能 〔8 〕 的一种方式 。研究表明凋亡相关基因 , 如 Bax可 以通过改变线粒体膜的通透性 ,使细胞色素 C 自线 〔9 〕 粒体释放 , 激活特异性 Caspase 23 依赖的信号途 径 ,诱导凋亡的发生 , 且 Caspase 23 在细胞凋亡调控 〔10 〕 过程中居中心地位 。而细胞凋亡和细胞增殖共 同调节细胞数量的动态平衡状态 , 在慢性肾脏疾病 早期细胞凋亡机制促进增殖的肾小球系膜细胞凋 亡 ,进而减少 ECM 积聚 , 使增生的肾小球系膜细胞 〔11 〕 数量恢复正常的有效途径 。 本实验结果提示 3 组不同浓度药物均可不同程 度抑 制 体 外 培 养 的 肾 小 球 系 膜 细 胞 增 殖 、升 高 Caspase 23 活性表达及诱导其凋亡 ( P < 0101 ) ; 3 组 组间相同浓度药物对肾小球系膜细胞增殖 、Caspase 2 3 活性表达及其凋亡的影响比较 , 均有显著性差异 ( P < 0101 ) , 尤以青蒿素联合地塞米松高剂量组作 用最强 , 3 组药物对肾小球系膜细胞增殖 、Caspase 23 活性表达及其凋亡的影响均呈剂量依赖趋势 , 其中 在中剂量和高剂量药物联合治疗组中出现了系膜细 参 考 文 献 phospholip ids and mesangial cell intracellular signaling pathways: role in the pathobiology of kidney disease [ J ] 1 H istol H istopa thol, 2005, 20 ( 2 ) : 603 26131 [ 2 ] 曹红卫 ,郭毅斌 ,王宁 ,等 1青蒿素对脓毒症大鼠的保护 作用 [ J ] 1 第三军医大学学报 , 2007, 29 ( 10 ) : 951 29541 [ 3 ] A ldieri E, A tragene D , Bergandi L , et a l1 A rtem isinin in2 hibits inducible nitric oxide synthase and nuclear factor κB activation [ J ] 1 FEB S L ett, 2003, 552 ( 2 23 ) : 141 2 NF 2 1441 [ 4 ] Singh NP, Lai HC1 A rtem isinin induces apop tosis in human cancer cells[ J ] 1 A n ticancer R es, 2004, 24 ( 4 ) : 2277 222801 [ 5 ] 张伟辉 ,郑彪 ,薛东波 ,等 1青蒿素诱导急性胰腺炎胰腺 腺泡细胞凋亡的实验研究 [ J ] 1 中国普外基础与临床杂 志 , 2007, 14 ( 4 ) : 388 23911 [6 ] 谢红 ,姚丽 ,陈立军 ,等 1 青蒿素对人白血病细胞 Caspase23 及细胞色素 C 表达的影响 [ J ] 1 中华中医药 学刊 , 2008, 26 ( 12 ) : 2648 226501 [ 7 ] Johnson R J, Hurtado A ,M erszei J, et a l1 Hypothesis: dys2 regulation of immunologic balance resulting from hygiene and socioeconom ic factors may influence the ep idem iology and cause of glomerulonephritis worldw ide [ J ] 1 Am J Kid 2 ney D is, 2003, 42: 575 25811 [ 8 ] Pearce JM 1 Apop tosis[ J ] 1 Eu r N eu rol, 2008, 60 ( 2 ) : 112 2 1161 [ 9 ] M aurerM , TsaiM ,M etzM , et a l1 A role for Bax in the reg2 ulation of apop tosis in mouse mast cells[ J ] 1 J Invest D er2 m a tol, 2000, 114 ( 6 ) : 1205 212061 [ 10 ] Ravagnan L , Roum ier T, Kroemer G1 M itochondria, the killer organelles and their weapons[ J ] 1 J Cell Physiol, 2002, 192 ( 2 ) : 131 21371 [ 11 ] Baker AJ,Mooney A , Hughes, et a l1 M esangial cell apop 2 tosis: the major mechanism for resolution of glomerular hy2 percellularity in experim ental mesangial p roliferative ne2 phritis[ J ] 1 J C lin Invest, 1994, 94 ( 5 ) : 2105 222161 《中药材 》 杂志为国内外权威的中药科技学术期刊 ,欢迎投稿 !