元宝枫组织培养育苗技术规程

65.020.20 ICS B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1588—2019 元宝枫组织培养育苗技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Acer Truncatum Bunge 2019-01-18 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-04-18 实施 发 布 DB15/T 1588—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境及器具灭菌 .................................................................... 1 5 培养基配制 ........................................................................ 2 6 外植体及其灭菌 .................................................................... 3 7 初代培养 .......................................................................... 4 8 增殖继代培养 ...................................................................... 4 9 生根培养 .......................................................................... 4 10 炼苗移栽 ......................................................................... 5 附录 A（资料性附录） MS 表 A.1 培养基母液配制表 ............................................ 7 MS 培养基母液配制表 ........................................................ 7 附录 B（资料性附录） 常用植物生长物质的母液配置 ...................................... 8 表 B.1 常用植物生长物质的母液配置 .................................................. 8 I DB15/T 1588—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有 限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司、赤峰市园林管理局。 本标准主要起草人：赵泉胜、赵鹏武、铁英、封卫平、斯琴毕力格、王娟、田菊、王淑杰。 II DB15/T 1588—2019 元宝枫组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了元宝枫组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初 代培养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。 本标准适用于元宝枫组织培养技术生产。 2 规范性引用文件 下列文件对本文的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组培瓶苗 tissue-culture container seedling 经组织培养形成、尚未出瓶（试管）的完整植株。 3.2 过滤灭菌 filter sterilization 对不耐高温的植物生长调节物质，采用孔径小于0.45 μ m 的滤网膜过滤消除杂菌的方法。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min～40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 1 DB15/T 1588—2019 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min～40 min，无菌风吹40 min以上。然后用70%酒精喷洒台面及操作台 内部空间。定期清洗超净工作台的过滤膜以确保过滤膜清洁，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净， 晾干，安装，紫外灯照射灭菌。 4.5 器具消毒灭菌 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 ℃、时间30 min。使用前用 酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再清洗培养瓶。或者用75%乙醇灭菌后再清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基的选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 母液中的大量元素、铁盐、微量元素及有机成分（甘氨酸、叶酸）混合配制，肌醇单一配制，具体 参数见附录A；植物生长调节物质单一配制，见附录B。 5.2.2 母液的保存 母液配制完成后，贴上标签、注明日期，并置于4 ℃冰箱存放，在有效期内使用。使用前观察无结 晶无异色。 5.3 培养基的配制 5.3.1 准备 根据培养基成分准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂，同时准备好移液枪、量筒、量杯、 天平、药匙、磁力搅拌器、pH计等工具。 5.3.2 琼脂融化 加蒸馏水 700 mL/L左右，再加入5 g/L琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，加入30 g/L蔗糖，搅拌使糖溶解。 2 DB15/T 1588—2019 5.3.4 加母液 糖溶解后，吸取母液，再根据不同培养基要求加入耐高温激素(不耐高温的激素，如吲哚丁酸（IBA）、 细胞分裂素（6-BA）等，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入)，充分搅拌。 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，测定pH值，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节至pH 5.8。 5.3.7 分装 使用240 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 应用高压灭菌锅进行灭菌，温度121 ℃，时间15 min～20 min。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基放在超净工作台冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应注明编号。在4 ℃无菌条件下贮藏备用，贮存时间不超过一个月。 6 外植体及其灭菌 6.1 外植体采集 4～5月份，晴天上午10点至下午4点之间，选采无病虫害、生长健壮幼龄植株，选取1年生枝条截取 中上部腋芽饱满的茎段作为外植体。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 初步灭菌 将茎段用洗洁精水全面刷洗表面，之后用自来水流水冲洗 30 min，将茎段放在超净工作台上备用。 6.2.2 深度灭菌 将初步灭菌的茎段用70%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.5%～2%的次氯酸钠浸泡15 min，用 无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台内，将深度灭菌的茎段均匀切分成长度1 cm～2 cm的小段，每个小段含1个芽。 3 DB15/T 1588—2019 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养选用MS + IBA 0.01 mg /L + 6-BA 1. 5 mg /L。 7.2 外植体接种 在超净工作台内，将外植体接种到预先准备好的初代培养基上，每瓶培养基均匀接种3个小段，下 部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注明编号。 7.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。待无根瓶苗萌发的腋芽生长至5 cm时， 切段进行增殖继代培养。 7.4 培养环境 培养室温度在25 ℃±2 ℃，相对湿度70%～80%，光照强度1500 lx～3000 lx，光照时间16 h/d。 8 增殖继代培养 8.1 增殖培养基 培养基选用MS + IBA 0.1 mg /L +6-BA 1.0 mg /L。 8.2 增殖转接 在超净工作台内，将初代培养的无根瓶苗切成长度2 cm左右的小段，每个小段上保留有1个芽，作 为增殖继代培养的材料。每瓶培养基均接种3个小段。小段下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注 明编号。 8.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。 8.4 培养环境 培养室温度25 ℃±2 ℃，相对湿度70%～80%，光照强度1500 lx～3000 lx，光照时间16 h/d。 8.5 培养期 增殖培养期为30 d-50 d。 9 生根培养 9.1 生根培养基 选用1/2 MS + IBA 0. 1 mg /L。 4 DB15/T 1588—2019 9.2 生根转接 当增殖培养的无根瓶苗生长至2. 0 cm～3. 0 cm时，在超净工作台内，从培养基上部剪取生长健壮、 大小相近的无根瓶苗转接在生根培养基上进行生根培养，每瓶3株，插入深度为1.0 mm～1.5 mm，保持 直立。 9.3 培养方法 将转接完毕的培养瓶置于组培架上，培养20 d～45 d即可生根。尚未生根的每30 d更换培养基1次。 9.4 培养条件 培养室温度25 ℃±2 ℃；相对湿度70%～80%；光照强度1500 lx～3000 lx；光照时间为16 h/d。 10 炼苗移栽 10.1 瓶苗炼苗 生根培养后，选择有3～5片正常绿叶、苗高5 cm～6 cm、具有2 cm～3 cm条白色嫩根的组培瓶苗， 保持环境温度25 ℃±2 ℃，光照强度1500 lx～2000 lx左右，进行过渡炼苗1周。之后将瓶盖逐步打开 进行开瓶炼苗。步骤：首先松盖1 d～2 d，然后半开盖1 d～2 d，最后完全开盖3 d～5 d。 10.2 温室穴盘炼苗 10.2.1 基质 采用体积比为河沙﹕草炭﹕珍珠岩=5﹕3﹕2混合物为基质。用多菌灵800倍液浸湿基质，用塑料布 覆盖灭菌24 h后使用。 10.2.2 穴盘 穴盘容器规格选用孔径8 cm、深度8 cm。 10.2.3 填装基质 用灭菌后的基质填充穴盘容器到饱满位置后，用刮板刮去多余基质，适当喷淋清水保湿，待用。 10.2.4 瓶苗清洗 将组培瓶苗取出，用常温清水洗去基部培养基，避免破坏苗根及幼苗。 10.2.5 穴盘栽植 将清洗完毕的组培苗植入穴盘基质居中位置，保持组培苗根系舒展，扶正茎叶，轻压幼苗周边基质。 将植满幼苗的穴盘置于温室苗床上，常温清水饱和喷淋一次。 10.2.6 温湿度管理 每天喷雾，使环境湿度保持在80%～90%之间，昼温21 ℃～29 ℃，夜温18 ℃～21 ℃。可用薄膜覆 盖保持湿度，采取遮阴措施，避免阳光直射。1周以后，逐渐减少喷雾次数。 5 DB15/T 1588—2019 10.2.7 病害防治 温室使用前要进行1次彻底的消毒灭菌，用百菌清烟雾剂熏蒸3～4次。穴盘栽植后每隔 7 d喷施1 次800倍液多菌灵或 50% 代森锰锌或 70%甲基托布津等杀菌剂。 10.3 温室容器培育 10.3.1 容器移栽 穴盘炼苗后，当苗木叶色深绿、叶片增大、新叶长出且形成根团时，将穴盘中的幼苗连同基质一起 移栽到相同基质的直径18 cm、深度20 cm的容器中，置于温室苗床继续培养，培养时间不少于2个月。 10.3.2 水肥管理 移栽后遮阴，4 d～5 d内每天向叶面喷水1～2次，1周后逐渐撤掉遮阴。之后，每隔20 d向苗木喷 2 2 施0.2%～0.3%的尿素1次，用量为3 g/m ～5 g/m 。 10.3.3 病虫害防治 发现虫害、病害及时药物治疗： ——危害元宝枫苗木的害虫主要有京枫多态毛蚜、黄刺蛾、天牛、尺蠖等，应用黄色粘虫板驱避蚜 虫，用辛硫磷 800 倍液喷施防治黄刺蛾、天牛、尺蠖。 ——常见的病害有叶斑病、褐斑病和白粉病，可用 50%的多菌灵可湿性粉剂 800 倍液喷施，每半月 喷施 1 次，连续 2～3 次。 10.3.4 大田培育 春季将容器苗放置在室外遮阴棚内过渡1～2周，遮阴棚使用透光率为80%的遮阴网，移入大田培养。 6 DB15/T 1588—2019 AA 附 录 A （资料性附录） MS 培养基母液配制表 表 A.1 MS 培养基母液配制表 母液名称 大量元素 铁盐 微量元素 编号 A 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg NH4NO3 1650 20 33000 KNO3 1900 20 38000 CaCl2·2H2O 440 20 8800 MgSO4·7H2O 370 20 7400 KH2PO4 170 20 3400 FeSO4·7H2O 27.8 100 2780 Na2EDTA·2H2O 37.3 100 3730 MnSO4·4H2O 22.3 100 2230 ZnSO4·7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4·2H2O 0.25 100 25 CuSO4·5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 100 2.5 2 200 400 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 肌醇 100 50 5000 母 液 定容体 配制培养基吸 积 mL 取量 mL/L 1000 50 1000 10 500 5 1000 5 500 10 B C 甘氨酸 D 有机成分 E 7 DB15/T 1588—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 常用植物生长物质的母液配置 表 B.1 常用植物生长物质的母液配置 类别 种类 配制方法 6-BA 细胞分裂素 KT ZT 2-iP 0.1～0.2 先用少量 0.1mol/L 的盐酸(HCl) 溶解，然后加蒸馏水定 容。 生长素 先用少量 0.1mol/L 的 KOH 或 NaOH 0.2～5.0 0.01～0.5 2，4-D 0.2～2.0 0.01～2.0 先用少量酒精溶解，然后加水定 _________________________________ 8 0.05～2.0 0.05～1.0 溶解，然后加蒸馏水定容。 GA3 0.05～2.0 0.5～5.0 NAA 赤霉素 0.05～2.0 0.1～1.0 IAA IBA 常用浓度(mg/L) 0.01～0.5